抗體是在病原物刺激下由B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞后所產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，具有高特異性結(jié)合抗原的能力。在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中，可根據(jù)其綁定能力和用途分為初級抗體（一抗）和次級抗體（二抗），但在選擇最合適的抗體時應(yīng)該考慮哪些影響因素呢？
一抗的選擇
一抗（primary antibody）是一種免疫球蛋白，能特異性結(jié)合特定蛋白或重點(diǎn)研究的其他生物分子，目的是對其進(jìn)行純化、檢測和測量。使用小鼠、大鼠、兔子、山羊和其他動物作為寄主，可將一抗培育成多克隆（pAb）或單克隆抗體（mAb）。在實(shí)驗(yàn)時選擇一抗可根據(jù)以下幾個方面進(jìn)行考慮：
確定實(shí)驗(yàn)種屬和類型
- 明確實(shí)驗(yàn)所需的樣本種屬，如人、鼠、豬等，應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體。
- 確定實(shí)驗(yàn)類型，如WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等，一般抗體說明書會列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過，適用于何種分析類型，如未提及并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而是說明尚未經(jīng)過此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證。如果抗體不適用某些分析試驗(yàn)，則會在抗體說明書上標(biāo)注出來不適于某分析試驗(yàn)。
抗體類型
- 單克隆抗體：由單一B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的高度均一、僅識別某一特定抗原表位的抗體。單抗實(shí)驗(yàn)時可產(chǎn)生極少或無背景染色，同時可減少與非目的蛋白的交叉反應(yīng)。
- 多克隆抗體：由動物的多個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生，是具有針對抗原幾個表位的多種抗體混合物。多抗可識別抗原的微小變異，能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的抗原檢測信號，是涉及變性蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)首選抗體。（單抗與多抗區(qū)別及選擇）
分析樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
分析了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，抗體說明書一般有相關(guān)免疫原的描述。若打算檢測的是蛋白片段或是一種特殊的同型物又或是蛋白全長的某一區(qū)域，則必須選擇用含有此片段域的免疫原制備的抗體。
抗體宿主物種的選擇
一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇較為重要。對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)。例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。
如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大。
二抗的選擇
二抗（secondary antibody）能直接與靶抗原連接的一抗結(jié)合。在一抗與抗原結(jié)合后，標(biāo)記的二抗將其V區(qū)附著到一抗的莖或C區(qū)。利用這種相互作用使二抗間接地進(jìn)行檢測和純化靶蛋白（抗原）。
通常情況下，在某一特定的實(shí)驗(yàn)中可能同時有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到最適合該實(shí)驗(yàn)的二抗，需要綜合以下幾個方面進(jìn)行考慮：
種屬來源
一般根據(jù)一抗的種屬來源來選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。例如：一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則為抗小鼠的二抗（山羊或是兔抗小鼠）。
抗體純化
①親和純化：大部分偶聯(lián)二抗可通過親和色譜法純化。
②預(yù)吸附：將含有二抗的溶液通過固定有血清蛋白（源自可能發(fā)生交叉反應(yīng)的物種）的色譜柱填料。非特異性二抗將保留在色譜柱內(nèi)，而具有高度特異性的二抗將流出色譜柱。
- 預(yù)吸附的二抗已經(jīng)過附加純化步驟，因此其特異性提高且交叉風(fēng)險降低；
- 在使用吸附有源自親緣關(guān)系較近物種抗體的二抗時，因?yàn)槠浔砦蛔R別能力已大幅下降并且可能對某些單抗的識別能力較差，選擇時需更加謹(jǐn)慎。（了解更多抗體純化方法）
抗體亞型
多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，相應(yīng)二抗應(yīng)為抗IgG抗體；單克隆抗體由于存在不同的類別和亞型，二抗選擇時需要根據(jù)一抗類型或是亞類相匹配。
完整片段還是抗體片段
二抗分為完整抗體和抗體片段兩種，使用哪種需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行決定。主要有IgG分子完整抗體、Fab片段以及F(ab’)2片段。
- 較小的抗體片段能夠更加高效地滲透組織，該特點(diǎn)對IHC及IF等實(shí)驗(yàn)應(yīng)用特別有利；
- 采用抗體片段可減少抗體Fc部分與細(xì)胞上Fc受體之間的非特異性結(jié)合，這一點(diǎn)在分析Fc受體含量高的特定組織（例如脾）時非常有幫助。
偶聯(lián)物
二抗的選擇還取決于偶聯(lián)的標(biāo)記物。二抗可以偶聯(lián)不同標(biāo)記物如酶（如HRP）、熒光素（如FITC）、生物素及同位素等，形成不同的標(biāo)記抗體。偶聯(lián)物的選擇會對抗體靈敏度產(chǎn)生極大的影響；生物素偶聯(lián)物有利于放大信號，聚合物的酶促偶聯(lián)物或熒光偶聯(lián)物也有利于放大信號。