什么是流式細(xì)胞術(shù)？

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是在流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)上，對處于快速直線流動狀態(tài)的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個、多參數(shù)、快速定性、定量分析的一種高新技術(shù)，具有高通量、多參數(shù)、速度快，采集數(shù)據(jù)量大、操作靈活等優(yōu)點。最開始檢測單細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量，蛋白質(zhì)或線粒體等大分子結(jié)構(gòu)和細(xì)胞動力學(xué)，到如今拓展到細(xì)胞表面標(biāo)志及抗原決定簇的研究、細(xì)胞抗原表達(dá)、免疫功能測定、細(xì)胞分選和鑒定、基因表達(dá)蛋白檢測、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子鑒定等多個研究領(lǐng)域，在市場上應(yīng)用極為廣泛。

流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞術(shù)為核心技術(shù)，集光學(xué)、電子學(xué)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)以及激光和計算機等多門學(xué)科和技術(shù)于一體的先進(jìn)科學(xué)技術(shù)設(shè)備。是現(xiàn)代科學(xué)研究中的先進(jìn)儀器之一，被譽為實驗室的”CT”。流式細(xì)胞儀主要由液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、檢測分析系統(tǒng)三部分組成。部分儀器在電子系統(tǒng)中具有分選功能，通過對粒子進(jìn)行充電和偏轉(zhuǎn)，達(dá)到對細(xì)胞的分選并分析的目的。

流式細(xì)胞術(shù)原理

利用流式細(xì)胞術(shù)快速精確的對單個細(xì)胞的理化性質(zhì)進(jìn)行定量分析和分選，主要通過幾個步驟：制備單細(xì)胞懸液，用特異性熒光染料標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，經(jīng)染色后的待測細(xì)胞在一定氣體壓力下被壓入流動室，在鞘液的包裹下細(xì)胞呈單行排列，依次通過檢測區(qū)域，在激光束的照射下細(xì)胞會產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號會同時被光電倍增管( PMT) 接收。接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號，進(jìn)行分析。

流式細(xì)胞術(shù)實驗流程

單細(xì)胞懸液的制備

流式細(xì)胞術(shù)檢測的對象一般是細(xì)胞，并且是呈獨立狀態(tài)的懸浮于液體中的細(xì)胞。如果要檢測組織中的細(xì)胞，須先將組織制備成單細(xì)胞懸液。如果該培養(yǎng)細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，需用胰酶消化處理；如果是胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等外周免疫器官，直接將臟器用研磨制成單細(xì)胞懸液；如果是實體臟器（如肺臟、肝臟和腫瘤組），細(xì)胞之間結(jié)合較緊密，將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內(nèi)切酶進(jìn)行細(xì)胞消化后再進(jìn)行研磨。

熒光標(biāo)記與上樣

細(xì)胞懸液制成后，用特異性熒光標(biāo)記的抗體與細(xì)胞上的抗原結(jié)合以達(dá)到對細(xì)胞熒光標(biāo)記（染色）。在恒定氣體的壓力下進(jìn)入流動室，不含細(xì)胞或微粒的緩沖液（鞘液^[1]）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流形成一定角度，鞘液包繞著樣品高速流動，組成一個圓柱形的液流束，待測細(xì)胞或微粒在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。

激光照射及熒光信號收集

流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過聚焦的光束垂直照射在樣品流上，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測，這種信號基本上反映了細(xì)胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。

數(shù)據(jù)處理分析

熒光信號的強度代表了所測細(xì)胞膜表面抗原強度或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的濃度，光信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的電信號。計算機把所測量的各種信號進(jìn)行處理分析。

細(xì)胞分選

細(xì)胞分選是指根據(jù)所測定的各個參數(shù)將指定的細(xì)胞從細(xì)胞群體中分離出來，流式分選的不是細(xì)胞而是包裹了細(xì)胞的液滴。在流動室的噴口上方配有一個超高頻的壓電晶體，產(chǎn)生的振動使噴出的液流形成均勻的液滴，待測細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負(fù)不同的電荷（對標(biāo)有熒光素的細(xì)胞液滴帶以負(fù)電荷；未標(biāo)記熒光素的細(xì)胞液滴帶以正電荷；而不含有細(xì)胞的液滴則不被帶電荷），當(dāng)液滴流經(jīng)偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不帶電荷的液滴落入廢液容器，從而實現(xiàn)細(xì)胞的分離。

實驗對照設(shè)置

合理的實驗對照是流式實驗成功的關(guān)鍵，下面介紹五種實驗中必備的實驗對照：

• 生物學(xué)對照：利用已知的陰性樣品和已知的陽性樣品設(shè)置對照。例如從文獻(xiàn)中查閱已知的表達(dá)/缺乏感興趣抗原表達(dá)的細(xì)胞，或使用RNAi或CRISPR技術(shù)將抗原敲除的細(xì)胞產(chǎn)生陰性細(xì)胞等。
• 空白對照：在流式上機檢測之前設(shè)置不加任何染料的細(xì)胞作為空白對照，得到的熒光信號是細(xì)胞本身的非特異性熒光。
• 同型對照：Fc受體位于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞上。它們通過其恒定的Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合抗體，這種結(jié)合會導(dǎo)致假陽性。為了防止這種類型的結(jié)合設(shè)置了加入FC受體封閉劑，再加入目標(biāo)抗體的isotype作為同型對照，排除細(xì)胞FC受體造成的假陽性結(jié)果。
• 單染和補償對照：當(dāng)進(jìn)行多色流式實驗時，需要設(shè)置單染管進(jìn)行補償調(diào)節(jié)。一般單染管要求有明顯的陽性細(xì)胞群，對于抗原表達(dá)弱的情況，則需要借助補償微球。

常見問題及分析

1. 細(xì)胞無染色或弱染色

• 細(xì)胞自發(fā)熒光較高：改變抗體的熒光染料形式。避開與自發(fā)熒光相同發(fā)射光的染料；
• 熒光染料淬滅：熒光抗體和熒光抗體染色后的樣本都應(yīng)該避光保存；
• 激光器性能異常：使用流式細(xì)胞儀設(shè)定&跟蹤微球，以檢查激光的校準(zhǔn)和功能；
• 數(shù)據(jù)過度補償：利用單染色對照和熒光減一對照為每次實驗設(shè)定補償；

2. 高背景或存在非特異性染色

• 二抗/試劑存在非特異性結(jié)合：滴定二抗，使本底降至最低程度，阻斷Fc受體，確保使用已經(jīng)被高度認(rèn)可無非特異性的二抗；
• 抗體濃度過高：更改抗體的用量；
• 染色時間太長：根據(jù)實驗細(xì)胞表達(dá)，優(yōu)化抗體濃度和孵育時間；
• 洗滌不充分：增加染色后的洗滌次數(shù)；

3. 染色異常情況

• 使用同型對照濃度不對：使用與檢測抗體濃度相同的同型對照；
• 使用同型對照來自不同的廠家：使用與實驗抗體同一廠家生產(chǎn)的同型對照；
• 固定/破膜液影響細(xì)胞固定：調(diào)整FSC/SSC電壓，使細(xì)胞處于可視范圍之內(nèi)。

注釋：

[1] 鞘液：鞘液是無熒光本底的平衡電解質(zhì)溶液，主要成份為氯化鈉、氯化鉀、乙二胺四乙酸二鈉等，作為流式細(xì)胞儀對細(xì)胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性進(jìn)行分析時的緩沖液使用，目的是包裹細(xì)胞使細(xì)胞呈直線單行排列流入細(xì)胞儀檢測區(qū)域。