單克隆抗體制備過(guò)程中，有兩次篩選過(guò)程，第一次是篩選出雜交瘤細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)）；第二次是進(jìn)一步篩選產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞（篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行克隆化）。

第一次篩選

在B細(xì)胞與瘤細(xì)胞融合的過(guò)程中，存在未融合的B細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞、“B細(xì)胞-B細(xì)胞”型融合細(xì)胞、“瘤細(xì)胞-瘤細(xì)胞”型融合細(xì)胞、“B細(xì)胞-瘤細(xì)胞”型融合細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）以及“B細(xì)胞-多個(gè)瘤細(xì)胞”型融合細(xì)胞等多種類(lèi)型。細(xì)胞融合后，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)是第一次篩選的關(guān)鍵。普遍采用的是HAT選擇性培養(yǎng)基。

HAT培養(yǎng)基成分

H：次黃嘌呤（Hypoxanthine，H）：完成次黃嘌呤核苷酸的補(bǔ)救途徑。

A：氨基蝶呤（Aminopterin，A）：葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑。

T：胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）：“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過(guò)補(bǔ)救途徑合成DNA。

HAT培養(yǎng)基的篩選原理

細(xì)胞DNA合成包括主要合成和補(bǔ)救合成兩種途徑。其中，主要合成是由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，再進(jìn)一步由核苷酸合成DNA的途徑。在此過(guò)程中，二氫葉酸還原酶作為重要的輔酶參與這一過(guò)程。

補(bǔ)救途徑是通過(guò)次嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase，HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase，TK）將次黃嘌呤和胸腺嘧啶合成相應(yīng)核苷酸，再進(jìn)一步合成DNA的途徑，在此過(guò)程中HGPRT與TK兩種酶缺一不可。

融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基篩選出的HGPRT缺陷型細(xì)胞株。其過(guò)程為：用8-氮鳥(niǎo)嘌呤對(duì)瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，它可以參與DNA合成的補(bǔ)救途徑，但是由此合成出來(lái)的DNA不能具備正常DNA的功能，因此這種細(xì)胞會(huì)死亡。存活下來(lái)的細(xì)胞都是不能進(jìn)行補(bǔ)救途徑合成DNA的瘤細(xì)胞。這種缺陷型的瘤細(xì)胞與B細(xì)胞進(jìn)行融合，融合后的細(xì)胞則既能通過(guò)主要途徑合成核苷酸，也能通過(guò)補(bǔ)救途徑合成核苷酸。

HAT培養(yǎng)基的選擇作用

  • 未融合的B細(xì)胞、B細(xì)胞-B細(xì)胞”型融合細(xì)胞：不能無(wú)限增殖，5～7天死亡。
  • “B細(xì)胞-多個(gè)瘤細(xì)胞”型融合細(xì)胞：不穩(wěn)定，幾乎不能存活。
  • 骨髓瘤細(xì)胞、“瘤細(xì)胞-瘤細(xì)胞”型融合細(xì)胞：合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又因自身缺乏HGPRT，阻斷了DNA補(bǔ)救合成途徑，不能在HAT培養(yǎng)液中增殖，5～7天死亡。
  • 雜交瘤細(xì)胞：既有骨髓瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的能力，又能利用B細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤核苷酸并最終與T一起合成DNA，在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖。

第二次篩選

在單克隆抗體的生產(chǎn)過(guò)程中，由于B細(xì)胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液第一次篩選出的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體也有差異（包括特異性抗體分泌細(xì)胞、無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞與抗體非分泌細(xì)胞等）。因此必須對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行第二次篩選，選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆化——即把培養(yǎng)孔中的細(xì)胞從單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，使之成為單克隆，其分泌的抗體達(dá)到均一性。

篩選分泌特定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的方法有直接接種法、有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法。其中最常用方法是有限稀釋法。

有限稀釋法

  • 制備飼養(yǎng)細(xì)胞層。
  • 調(diào)整雜交瘤細(xì)胞濃度。
  • 將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋?zhuān)臃N在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每孔細(xì)胞不超過(guò)一個(gè)，通過(guò)培養(yǎng)讓其增殖，然后檢測(cè)各孔上清液中的細(xì)胞分泌的抗體，上清液可與特定抗原性結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。此時(shí)，陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來(lái)自單個(gè)細(xì)胞，要繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋?zhuān)话阈枰貜?fù)3-4次，直至確保每孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。

注意

  • 對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌型細(xì)胞可能會(huì)被非抗體分泌型細(xì)胞所抑制，因?yàn)榉强贵w分泌型細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌型細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌型細(xì)胞丟失。
  • 即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

詳細(xì)步驟參考 單克隆抗體制備步驟及注意事項(xiàng)