免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）是基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色來對組織內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性、定量的一項(xiàng)技術(shù)。
根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理。從待測組織或細(xì)胞中提取蛋白作為抗原，先與一抗結(jié)合形成抗原抗體反應(yīng)物，再與生物素或熒光素標(biāo)記的二抗反應(yīng)，通過化學(xué)顯色可以在顯微鏡下清晰觀察到抗原抗體反應(yīng)物，從而能在組織切片上確定抗原的分布和含量。
免疫組化的分類
根據(jù)抗體標(biāo)記物的不同一般分為免疫酶標(biāo)法、免疫熒光法、親和組織化學(xué)法、免疫鐵蛋白法、免疫金法、放射免疫自影法。下面介紹兩種較為常用的兩種技術(shù)：
免疫熒光法
免疫熒光法是最早建立的免疫組織學(xué)技術(shù)。將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針，檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會(huì)發(fā)出一定波長的熒光，從而對組織中的抗原進(jìn)行定位或定量。
免疫酶標(biāo)法
免疫酶標(biāo)法是繼免疫熒光之后發(fā)展的應(yīng)用較為廣泛的免疫組化技術(shù)。先以酶標(biāo)記的抗體作用于組織或細(xì)胞，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性物質(zhì)或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對其進(jìn)行定位，從而對細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位或定性研究的一種方法。
免疫組化的應(yīng)用
IHC的原理是通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。人體內(nèi)很多器官和組織內(nèi)的組成細(xì)胞，由于起源一致，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上非常相似，很多時(shí)候是很難靠形態(tài)來區(qū)分。在過去沒有免疫組化的情況下，識(shí)別有很強(qiáng)的主觀性，錯(cuò)誤難以避免。免疫組化就像細(xì)胞的“血型”鑒定，靠它可以明確組織來源。由于免疫組化具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定位準(zhǔn)確等特點(diǎn)，且能將形態(tài)研究與功能研究有機(jī)結(jié)合在一起，所以這門新技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的許多領(lǐng)域。免疫組化在病理學(xué)診斷中的應(yīng)用主要包括：
- 確定細(xì)胞類型
- 辨認(rèn)細(xì)胞產(chǎn)物
- 了解分化程度
- 鑒定病變性質(zhì)
- 探討腫瘤起源或分化表型
- 確定腫瘤分期等
免疫組化材料的準(zhǔn)備
切片的選擇
- 石蠟切片：通過石蠟包埋固定好的組織標(biāo)本，并用切片機(jī)切片的方法。是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法。能保存好組織形態(tài)且可以做連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察，并且可以長期存檔做回顧性研究。但高溫烤片可能會(huì)破壞組織的抗原性。
- 冰凍切片：在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然后進(jìn)行切片的一種方法。能較好保存組織的免疫活性，在免疫組化時(shí)不需要抗原修復(fù)。但細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散，切片較厚不美觀。
抗體的選擇
- 單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對較低；而多克隆抗體特異性稍弱，抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色。
- 種屬來源：根據(jù)一抗的來源決定二抗的選擇。若一抗是小鼠來源，那么二抗選擇抗小鼠的即可（例如羊、兔）。
- 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測什么種屬的抗原選擇抗體，避免出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
- 購買之前咨詢該抗體是否可以做免疫組化。
- 一般可以做石蠟切片的抗體都可以用來做檢測冰凍切片，但可以做冰凍切片的抗體不一定能檢測石蠟切片。
免疫組化實(shí)驗(yàn)流程
實(shí)驗(yàn)步驟主要包括樣品制備以及樣品染色（以石蠟組織切片為例）
樣品制備
- 組織固定：根據(jù)要求收集人或動(dòng)物的組織用于IHC分析，沖洗并用固定劑（一般用甲醛）進(jìn)行固定
- 組織包埋：將經(jīng)甲醛固定的組織嵌入石蠟，以長期保持其天然形狀和組織結(jié)構(gòu)
- 切片安裝：將組織樣品在切片機(jī)上切片，并轉(zhuǎn)移至載玻片上干燥保持其形態(tài)
- 脫蠟水化：因切片上的石蠟會(huì)妨礙染色，所以需將切片上的石蠟溶出，并水化。脫蠟或水化不全容易造成非特異性背景著色（一般的脫蠟水化步驟是：將切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-無水乙醇5min-95%無水乙醇5min-90%無水乙醇5min-80%無水乙醇5min-70%無水乙醇5min-50%無水乙醇5min-蒸餾水5min×3，進(jìn)行脫蠟水化）。
- 抗原修復(fù)：由于組織在甲醛固定過程中，蛋白之間發(fā)生了交聯(lián)及醛基的封閉從而掩蓋抗原決定簇?？梢酝ㄟ^高壓加熱修復(fù)抗原，使細(xì)胞內(nèi)抗原決定族暴露，從而提高抗原檢測率
- 非特定位點(diǎn)封閉：為了防止一抗的非特異性結(jié)合造成假陽性，可以選用BSA、羊血清等封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉血清來源一般與二抗保持一致，室溫封閉10-30min
樣品染色
- 一抗、二抗孵育：抗體孵育時(shí)間、溫度及濃度等因素對染色結(jié)果都存在很大影響。在4℃下反應(yīng)緩慢，背景較淺；37℃反應(yīng)較快時(shí)間較短；而室溫介于兩者之間，選擇室溫有利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。二抗一般室溫孵育30min
- 底物顯色：基于與酶綴合的二抗，抗原通過生色或熒光方式直接檢測
- 復(fù)染封片：組化染色后進(jìn)行復(fù)染可以襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，常用的復(fù)染劑有蘇木精、曙紅、甲基綠、DAPI和Hoechst熒光染色。觀察結(jié)束后使用中性樹膠進(jìn)行封片，可以長久保存
常見問題分析
1. IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯色過深
- 一抗?jié)舛冗^高或孵育時(shí)間過長——降低一抗?jié)舛然驕p少孵育時(shí)間
- 孵育溫度過高——選擇4℃或室溫孵育
2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在非特異性顯色
- 石蠟切片脫蠟不徹底——延長脫蠟時(shí)間
- 蛋白封閉不充分——增加蛋白封閉時(shí)間
- 組織富含內(nèi)源性生物素與過氧化物酶——使用相關(guān)試劑進(jìn)行封閉
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯色弱或無染色
- 一抗?jié)舛冗^低或孵育時(shí)間過短——增加一抗?jié)舛然蜓娱L孵育時(shí)間
- 組織中無目的抗原的表達(dá)
- 一抗種屬來源與二抗不匹配