核糖體展示技術(shù)是一種篩選蛋白質(zhì)的強(qiáng)有力的工具。在一定條件下，將mRNA及蛋白同時(shí)結(jié)合在核糖體上，以非共價(jià)鍵的形式形成“蛋白質(zhì)—核糖體—mRNA”（PRM）三元復(fù)合物，通過將基因型和蛋白表型聯(lián)系在一起，利用目標(biāo)蛋白的特異性配基從蛋白質(zhì)展示文庫(kù)中篩選出目標(biāo)蛋白和相應(yīng)基因序列。
圖1核糖體展示技術(shù)
近年來,核糖體展示技術(shù)在單鏈抗體(ScFv)庫(kù)構(gòu)建及應(yīng)用方面取得了很大進(jìn)展。
核糖體展示抗體庫(kù)原理
進(jìn)行核糖體展示，首先需要設(shè)計(jì)一段不含終止子的序列，能夠在一定條件下，使mRNA、蛋白質(zhì)和核糖體相連，形成以非共價(jià)鍵形式存在的“蛋白質(zhì)-核糖體-mRNA”三元復(fù)合物，運(yùn)用PCR技術(shù)構(gòu)建用于核糖體展示的DNA庫(kù)；然后，依次進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄、體外翻譯和親和篩選。經(jīng)純化得到的所需抗體的mRNA，運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即RT-PCR技術(shù)得到編碼該抗體的cDNA，再以cDNA為模板繼續(xù)進(jìn)行下一輪的表達(dá)和篩選。核糖體展示技術(shù)模擬了體內(nèi)抗體的進(jìn)化過程，最后得到的篩選產(chǎn)物序列十分相似，均來源于核糖體展示前的原始序列?？傮w說來，核糖體展示技術(shù)主要由3部分構(gòu)成：構(gòu)建模板、體外轉(zhuǎn)錄、體外翻譯和親和篩選。
構(gòu)建流程：
（1）構(gòu)建模板
核糖體展示模板由4個(gè)部分組成：5′非編碼區(qū)、編碼區(qū)、間隔區(qū)序列、3′非編碼區(qū)。
- 5′非編碼區(qū)，包括T7啟動(dòng)子序列和SD序列。
- 編碼區(qū)除了目的序列外，C末端還含有一段作為間隔子的基因序列，以保證蛋白構(gòu)象，避免蛋白構(gòu)象，避免影響蛋白質(zhì)折疊，因?yàn)楹颂求w在翻譯時(shí)，也會(huì)占據(jù)20-30個(gè)氨基酸左右的空間位置。
- 3′非編碼區(qū)，不含終止密碼子，以保證合成的蛋白與核糖體和mRNA形成三元復(fù)合物。
- 模板兩端各有一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，頸環(huán)結(jié)構(gòu)能夠有效保護(hù)mRNA模板避免核酸外切酶的降解。
（2）體外轉(zhuǎn)錄與體外翻譯
體外轉(zhuǎn)錄與體外翻譯可以偶聯(lián)進(jìn)行，也可以分別進(jìn)行。
體外表達(dá)可以利用來自原核的E.coliS30無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，或真核的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液和麥胚提取物的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，目前已有以DNA為模板的體外蛋白翻譯系統(tǒng)和以RNA為模板的體外轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)的商用系統(tǒng)問世。
若分別進(jìn)行，則需要控制RNase的影響。VRC—過渡態(tài)類似物—作為RNase抑制劑，能有效抑制核酸酶，提高E.coli核糖體展示效率。翻譯結(jié)束后立即冷卻反應(yīng)混合物，所有篩選步驟在冰上進(jìn)行降低RNase的影響。另外3′端和5′端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)也可以使mRNA避免核酸外切酶RNaseⅡ和核酸內(nèi)切酶RNase E的影響。
（3）親和篩選
體外翻譯反應(yīng)結(jié)束后，“mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物保持完整，就可以通過目標(biāo)蛋白質(zhì)與相應(yīng)配體的結(jié)合特征對(duì)核糖體展示文庫(kù)進(jìn)行篩選。篩選方法分為固相篩選和液相篩選2種方式。固相篩選是將靶分子結(jié)合到固相支持物上；液相篩選是將靶分子結(jié)合到固相支持物上；液相篩選是在靶分子上連接捕獲標(biāo)簽，如生物素，然后在形成復(fù)合物后，捕獲該標(biāo)簽，進(jìn)行親和篩選?；蛑苯訉蟹肿咏Y(jié)合到磁珠上進(jìn)行篩選。
mRNA的分離：篩選完后，加入含20mmol/L EDTA的冰冷緩沖液洗脫mRNA。洗脫下來的mRNA用DNase I處理，去除殘留的DNA模板，進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)重新引入T7啟動(dòng)子和SD序列等核糖體展示必須元件用于下一輪展示，或直接進(jìn)行Northern雜交，評(píng)價(jià)篩選效率。將最后一輪篩選到的靶標(biāo)基因與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，可以得到單個(gè)靶標(biāo)克隆。進(jìn)一步采用體外或體內(nèi)表達(dá)方式表達(dá)單鏈抗體分子，進(jìn)行活性鑒定。
（4）體外分子定向進(jìn)化
用核糖體展示技術(shù)對(duì)未變異的文庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí)，可以通過易錯(cuò)PCR或(DNA shuffering)等方法引入突變和重組技術(shù)，增加分子多樣性，從而提高獲得高親和力、良好穩(wěn)定性或增加酶活性靶標(biāo)分子的機(jī)率。
核糖體展示抗體庫(kù)優(yōu)劣分析
優(yōu)勢(shì)
- 建庫(kù)簡(jiǎn)單，建庫(kù)時(shí)間明顯縮短。
- 建庫(kù)容量大。
- 分子多樣性強(qiáng)、篩選方法簡(jiǎn)便、無需選擇壓力。
- 可通過引入突變和重組技術(shù)來提高靶標(biāo)蛋白的親和力等。
- 不需要考慮細(xì)胞毒性。
劣勢(shì)
- mRNA易降解，所以mRNA的穩(wěn)定性仍然成為體外核糖體展示系統(tǒng)的主要缺陷。
- “mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物穩(wěn)定性較差，可能會(huì)影響展示系統(tǒng)的正常進(jìn)行。
- 大分子蛋白質(zhì)在核糖體上的展示效率低。
核糖體展示抗體庫(kù)應(yīng)用
- 篩選抗體
- 篩選非抗體類的蛋白質(zhì)
- 酶親和力分析
- 多肽的篩選與親和力分析
- 確定抗原決定簇
- 分子進(jìn)化
參考文獻(xiàn)：
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