酵母表面展示系統(tǒng)是繼噬菌體展示技術(shù)之后發(fā)展起來的一種真核展示系統(tǒng)。酵母表面展示是將特定肽/蛋白質(zhì)基因與酵母自身分泌到細(xì)胞外或定位在細(xì)胞壁上的基因融合，通常是a-凝集素(a-agglutinin)基因，利用酵母細(xì)胞作為展示顆粒，利用流式細(xì)胞儀定量篩選高親和力的特定肽。該技術(shù)能夠同時(shí)選擇表型和編碼基因。

酵母展示抗體庫的特點(diǎn)

  1. 酵母展示抗體庫原始容量的大小與篩選到的目的抗體的親和力有關(guān)，尤其是利用天然抗體庫篩選目的抗體。
  2. 酵母展示抗體庫技術(shù)可以利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行大容量篩選。
  3. 酵母的轉(zhuǎn)化效率低，約為大腸桿菌的1/10000。
  4. 酵母抗體庫展示通過抗性選擇來粗篩陽性克隆，當(dāng)克隆抗性丟失時(shí)會(huì)使抗體庫在篩選過程中陰性克隆過度增殖，從而干擾抗體庫的篩選。

利用酵母展示抗體庫篩選抗體的步驟

酵母展示重組載體的構(gòu)建

  1. 設(shè)計(jì)引物，通過PCR方法擴(kuò)增抗體基因片段。
  2. PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒按一定比例混合（通常PCR產(chǎn)物為質(zhì)粒的4~10倍），16℃條件下過夜連接。

酵母轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)

  1. 酵母EBY100單菌落用YPD培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。2次接種活化后用500ml培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。
  2. 4000r/min，4℃離心5min，收獲細(xì)胞，80ml無菌水重懸。在重懸液中加入10ml 10×TE Buffer，混勻后再加入10×LiAc貯存液，30℃緩慢搖動(dòng)45min，再加入2.5ml 1mol/L DTT，于30℃輕搖30min。
  3. 將重懸液用250ml冷水、30ml山梨醇溶液（1mol/L，4℃冷卻）依次清洗，離心后棄上清。最后用0.5ml相同濃度的山梨醇溶液重懸菌體。
  4. 每50 μl菌體加入小于100ng的DNA，電擊轉(zhuǎn)化，加450μl山梨醇溶液重懸菌體，取少量菌液稀釋涂板，30℃條件下培養(yǎng)72h，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。
  5. 分別接入含葡萄糖的YNB-CAA溶液中，30℃過夜培養(yǎng)至A600為3~4，4000r/min離心10min，收集細(xì)胞，用含半乳糖YNB-CAA調(diào)整細(xì)胞濃度至A600為0.5~1，30℃振蕩培養(yǎng)，分別于0和48h時(shí)取樣。

抗體庫篩選

  1. 將誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞重懸于5ml PBS緩沖液中，加入終濃度為100nmol/L的抗原，25℃孵育30min，冰浴5~10min后。3000r/min離心10min，棄上清，然后用50ml緩沖液清洗3次。
  2. 用5ml緩沖液重懸細(xì)胞，冰浴10min，每隔一會(huì)輕搖數(shù)下。加入40ml緩沖液進(jìn)行洗滌，離心后棄去上清，用50ml緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，渦旋振蕩。
  3. Miltenyi LS柱置于磁場，用3ml冰浴緩沖液沖洗，進(jìn)行預(yù)處理。一次性加入7ml細(xì)胞懸液，在沖洗停止后，將Miltenyi LS柱從磁場中取出，然后立即放回，使物理結(jié)合于柱上的細(xì)胞通過。在柱重新置于磁場后，再加入7ml細(xì)胞懸液。重復(fù)“取出-放回”操作。
  4. 用3ml緩沖液洗柱子，保證所有殘留細(xì)胞都被洗凈。將Miltenyi LS柱從磁場中取出，然后放回，加入3ml緩沖液，重復(fù)該步驟。
  5. 將Miltenyi LS柱從磁場中取出，加入7ml緩沖液，用柱塞將所有的結(jié)合細(xì)胞推入15ml圓錐底試管。
  6. 離心細(xì)胞，按要求重懸細(xì)胞：a. 第一輪篩選產(chǎn)物：100ml選擇緩沖液（青霉素/鏈霉素抗性）過夜培養(yǎng)，用葡萄糖抑制ScFv抗體的誘導(dǎo)表達(dá)。重復(fù)以上步驟進(jìn)行二次篩選。b. 第二輪篩選產(chǎn)物：500ml緩沖液重懸，進(jìn)行染色，以便進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選。
  7. 陽性細(xì)胞在含有抗性的5ml SD-CAA培養(yǎng)液中培養(yǎng)，30℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物變得渾濁時(shí)，可以誘導(dǎo)ScFv的表達(dá)，進(jìn)行第二輪篩選。
  8. 一般分選3輪后可得到明顯與抗原結(jié)合的細(xì)胞。
  9. 將單個(gè)細(xì)胞克隆接種培養(yǎng)，進(jìn)行抗原結(jié)合鑒定。陽性克隆進(jìn)行測序，鑒定不同的ScFv抗體。

參考文獻(xiàn)：

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