抗體配對(duì)

抗體配對(duì)是在抗體的基礎(chǔ)上，對(duì)抗體進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。其中參與配對(duì)的抗體能夠同時(shí)結(jié)合相同的抗原。通常情況下，一個(gè)抗原分子擁有多個(gè)抗原決定簇，將抗原直接注入到動(dòng)物體內(nèi)，可引起免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，針對(duì)不同的抗原決定簇會(huì)產(chǎn)生不同的抗體。產(chǎn)生的抗體具有特異性與專(zhuān)一性，即一個(gè)抗體分子只會(huì)特異性地結(jié)合一個(gè)抗原決定簇。兩個(gè)針對(duì)不同抗原決定簇的抗體，有可能同時(shí)結(jié)合到同一個(gè)抗原分子上，像這種結(jié)合到同一抗原分子上的兩個(gè)抗體就是配對(duì)抗體。

需要注意的是，即使兩個(gè)抗體針對(duì)的是同一抗原分子上不同的抗原決定簇，也并不意味著這兩個(gè)抗體分子一定可以同時(shí)與抗原分子結(jié)合。當(dāng)一個(gè)抗體與抗原結(jié)合后，有可能會(huì)導(dǎo)致其他結(jié)合位點(diǎn)（抗原決定簇）構(gòu)型的改變，從而導(dǎo)致其他的抗體無(wú)法正常結(jié)合到抗原上。此外，由于位阻效應(yīng)的存在，也可能使兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)距離較近的抗體無(wú)法同時(shí)結(jié)合在抗原上。因此，想要得到可以同時(shí)結(jié)合在抗原分子上的配對(duì)抗體，在制備出抗體后，還需要對(duì)抗體進(jìn)行篩選。

HRP酶標(biāo)抗體制備

實(shí)驗(yàn)步驟——過(guò)碘酸鈉氧化法：

稱(chēng)取5mgHRP酶，溶于0.5mL蒸餾水中
加入新配制的0.5mL（0.1mol/L）過(guò)碘酸鈉溶液，4℃靜置30min
加入0.5mL（0.16mol/L）乙二醇溶液，室溫避光混勻，靜置30min
加入含5mg抗體的水溶液1mL，混勻裝入透析袋，pH9.5碳酸鹽緩沖液透析，放4℃，過(guò)夜
加入0.2mL新配制的（0.5mg/mL）硼氫化鈉溶液，混勻，4℃靜置2h
邊攪拌邊滴加等體積飽和硫酸銨溶液，4℃靜置1h
3000r/min離心30min，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗滌2次
沉淀物溶于少量pH7.4（0.15mol/L）磷酸鹽緩沖液，透析過(guò)夜，去除銨離子后，10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物

注意事項(xiàng)：

為提高標(biāo)記效率，應(yīng)嚴(yán)格掌握整個(gè)反應(yīng)體系中的抗體含量。
ELISA法測(cè)定酶標(biāo)抗體效價(jià)。
碘酸鈉要新鮮配制。

配對(duì)抗體的篩選——雙抗體夾心ELISA法

取兩種效價(jià)高的單克隆抗體，一種作為捕獲抗體，另一種作為標(biāo)記抗體（HRP酶標(biāo)抗體），將捕獲抗體包被在固相載體上，先加入抗原，孵育后洗去未結(jié)合的抗原，使固相載體上形成抗體抗原復(fù)合物，并于液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入標(biāo)記抗體，孵育后洗去未結(jié)合的標(biāo)記抗體，最后加入顯色液顯色。

如果可以顯色，說(shuō)明該捕獲抗體與標(biāo)記抗體為一對(duì)配對(duì)抗體。可進(jìn)一步根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。
如果不能顯色，說(shuō)明該捕獲抗體與標(biāo)記抗體不是配對(duì)抗體。如果選擇的兩種單克隆抗體不能進(jìn)行配對(duì)，則需重新選擇兩種單抗，重新進(jìn)行試驗(yàn)，直至找出可以配對(duì)的抗體。

配對(duì)抗體篩選流程：

實(shí)驗(yàn)步驟：

稀釋?zhuān)河胮H9.6（0.01mol/L）碳酸鹽緩沖液將單克隆抗體稀釋至5μg/mL
培養(yǎng)：用捕獲抗體包被酶標(biāo)板后，4℃過(guò)夜
洗滌：用PBS/T20洗板3次，每次3min
封閉：用含3%小牛血清的PBS/T20封閉，37℃孵育1h，洗板
加抗原：加入倍比稀釋的抗原溶液，37℃孵育45min，洗板
加酶標(biāo)抗體：加入HRP-單克隆抗體，37℃孵育30min，洗板
顯色：加入TMB顯色液，輕輕震蕩混勻，37℃避光反應(yīng)15min
終止：加入50μL終止液終止反應(yīng)
測(cè)定：酶標(biāo)儀上讀取各孔讀取OD450值

注意事項(xiàng)：

加樣品與酶標(biāo)板時(shí)，應(yīng)加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
注意避光顯色。
測(cè)定應(yīng)在加終止液后15min以?xún)?nèi)及時(shí)測(cè)定。。

實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：HRP酶、過(guò)碘酸鈉、乙二醇、碳酸鹽緩沖液、硼氫化鈉、硫酸銨溶液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、PBS/T20、HRP-單克隆抗體、TMB顯色液。

實(shí)驗(yàn)儀器：離心機(jī)、冰箱、酶標(biāo)儀。