什么是免疫印跡Western Blot？
Western Blot蛋白免疫印跡是對目的蛋白進行檢測、分析以及定量的一種技術(shù)。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離后從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物（如PVDF膜）上，后用特異性抗體對某一特定的抗原進行著色，分析著色的位置或深度獲得該蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況。
蛋白質(zhì)免疫印跡的檢測方法主要有直接檢測和間接檢測兩種。間接檢測是加入未標記的第一抗體與抗原結(jié)合后，用酶/熒光團標記的二抗來檢測一抗，染色顯影后對目的蛋白進行分析;而直接檢測是用酶/熒光團綴合的一抗檢測印跡上的目的抗原，直接檢測在實驗操作中應用很少。
Western Blot實驗操作
常規(guī)試劑及材料
- PBST 、PBS 、Tween-20
- SDS-PAGE電泳液緩沖液
- Western blot轉(zhuǎn)膜緩沖液
- 10xTBS緩沖液
- 1xTBST緩沖液
- 封閉緩沖液：5%的脫脂奶粉溶液
- 一抗/二抗稀釋緩沖液
- 轉(zhuǎn)膜用的夾子，兩塊海綿墊，一支滴管，濾紙，一張PVDF膜，轉(zhuǎn)膜槽，轉(zhuǎn)移電泳儀，搖床，計時器，磁力攪拌器，轉(zhuǎn)子，Western blot盒，SDS-PAGE膠，脫脂奶粉
實驗流程
A：電泳分離蛋白質(zhì)，由裂解細胞或組織制備目的蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳處理后，不同分子質(zhì)量大小的蛋白質(zhì)得到分離。
B：轉(zhuǎn)膜，將電泳分離的條帶從凝膠轉(zhuǎn)移至NC/PVDF膜上。常用的方法是電洗脫或電泳轉(zhuǎn)移，形成“負極-海綿-三層濾紙-膠-膜-三層濾紙-海綿-正極”轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)，在施加電場后蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠中移出并吸附在膜表面。
C：抗體孵育，用目標蛋白的抗體（一抗）處理膜，漂洗除去未結(jié)合的抗體，膜上僅含有目標蛋白結(jié)合的一抗。再用標記的二抗進行酶免疫定位。
D：顯影分析，用x-ray底片曝光，根據(jù)信號的強弱調(diào)整曝光時間或不同時間多次壓片以達到最佳效果。曝光完成后取出x-光片迅速浸入顯影液中顯影，待條帶明顯后停止顯影，分析結(jié)果。
實驗注意事項
- 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜時濾紙與膠、膠與膜、膜與濾紙之間不能有氣泡，否則會影響轉(zhuǎn)膜的效果。
- 膜封閉：轉(zhuǎn)好的膜用TBST潤洗兩次， 再用5%脫脂奶粉溶液(TBST配制)常溫封閉一至兩小時，抑制抗體非特異性吸附膜上未反應的位點。
- 抗體的選擇：免疫實驗中標記的二抗是檢測靶抗原的最終手段。如果一抗是未修飾的小鼠單克隆抗體，二抗必須是從非小鼠宿主獲得的抗小鼠IgG第二抗體。
- 洗滌緩沖液：實驗中通過洗滌去除未結(jié)合的試劑并降低背景，增加信噪比。洗滌不充分會導致高背景；洗滌過度會使抗原/抗體從印跡中洗脫導致敏感性降低。
- 顯影和定影：移動時盡量手拿膠片一角避免劃傷影響結(jié)果。
常見問題分析
Western Blot 實驗結(jié)果背景值高？
- 膜沒有均勻浸潤——PVDF 膜轉(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕，轉(zhuǎn)膜前用緩沖液浸泡10min且一直保持膜的濕潤
- 膜或者緩沖液污染——拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液
- 封閉不充分——更換封閉液或延長封閉時間
- 抗體與封閉液出現(xiàn)交叉反應——檢測一抗、二抗是否與封閉液反應
- 抗體濃度過高——預實驗對抗體稀釋度進行調(diào)試，確定最適宜的濃度
Western Blot實驗結(jié)果中雜帶較多
- 一抗不是唯一特異的——制備單克隆抗體或者重新選取合成抗原多肽的位點制備抗體
- 二抗出現(xiàn)非特異性結(jié)合——對照只加二抗來檢測二抗是否有非特異性結(jié)合
Western Blot實驗結(jié)果無信號或信號弱
- 檢測樣品不表達目的蛋白——選擇表達量高的細胞作為陽性對照，確定檢測樣品是否為陰性
- 檢測樣品低表達目的蛋白——提高上樣量，裂解液中加入蛋白酶抑制劑
- 膜漂洗過度——減少漂洗的時間和次數(shù)
PVDF膜和NC膜的選擇
作為western blot實驗中的固相支持物，PVDF膜更為昂貴，結(jié)合能力更強，在蛋白質(zhì)截留能力，機械強度和化學相容性上都具有更優(yōu)越的性能，具有更好的機械強度和化學耐受性，使用時需要甲醛預處理（浸泡）。
NC膜（硝酸纖維素膜）機械性不及PVDF膜，比較脆弱，不能重復利用。但使用時不需預處理，且容易封閉，也不需要特別嚴謹?shù)那逑礂l件。