單細胞全基因組測序技術(shù)是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術(shù)。其原理是將單個細胞溶解得到的微量基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的單細胞基因組后，通過外顯子捕獲進行高通量測序，用于揭示細胞群體差異和細胞進化關(guān)系。在癌癥研究、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細胞分化、免疫機制、微生物等研究領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用。
技術(shù)流程
一、單細胞分離
進行單細胞測序，首先要進行單細胞的分離。雖然已有較成熟的用于分離在細胞群體中占多數(shù)的單細胞的技術(shù)，但分離在細胞群體中罕見（<1%）的單細胞仍是一項艱巨的挑戰(zhàn)。目前常用的單細胞分離方法主要有：連續(xù)稀釋法、口吸管技術(shù)、顯微操作法、熒光流式分選法、激光捕獲顯微切割技術(shù)以及微流控技術(shù)等。方法的選擇參考：單細胞分離技術(shù)。
二、全基因組擴增
單細胞中的DNA含量非常?。ㄍǔ＃?0pg/細胞），達不到測序儀的檢測要求，因此在測序前，必須要先進行擴增富集，才能進行下一步的實驗。
全基因組擴增技術(shù)（whole genome amplification，WGA）能夠?qū)崿F(xiàn)對整個基因組的擴增，為單細胞基因組測序提供了強有力的支持。現(xiàn)有的WGA技術(shù)按原理可分為三種類型：
1.基于熱循環(huán)以PCR為基礎(chǔ)的擴增技術(shù)
- 簡并寡核苷酸引物PCR（degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR）
- 連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR（ligation mediated PRC，LM-PCR）
- 擴增前引物延伸反應(yīng)（primer extension pre-ampification，PEP）。
2.基于等溫反應(yīng)不以PCR為基礎(chǔ)的擴增技術(shù)
- 多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）
- 基于引物酶的全基因組擴增(primer-based whole genome amplification，pWGA)技術(shù)。
3.基于特殊短分子DNA引物進行線性擴增的技術(shù)
- 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù)（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）。
實際研究中應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)的擴增方式。不同WGA原理詳見：單細胞全轉(zhuǎn)錄組擴增技術(shù)。
| WGA技術(shù) | 主要原理 | 最低DNA模板量 | 產(chǎn)物長度 | 基因組覆蓋度 | 擴增前后偏倚倍數(shù) | 應(yīng)用 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| DOP-PCR | 部分隨機引物法 | 50 pg | ＜2kb | ～40% | 61.8 | CGH，SSCP分析，SNP分型，STR分型 |
| LM-PCR | 連接介導(dǎo)的PCR反應(yīng) | 5 pg | ＜2kb | ～96% | — | CGH，LOH研究，STR分型 |
| PEP | 完全隨機引物法 | 5 pg | ＜2kb | ～50% | 220.5 | LOH研究，SNP分型，STR分型 |
| MDA | 多重置換擴增 | 10 pg | ＜100kb | ～73% | 19.8 | CGH，RFLP分析，SNP分型，STR分型 |
| pWGA | 體外再造T7噬菌體DNA復(fù)制 | 100 fg | ＜40kb | — | 6.3 | SNP分型，STR分型 |
| MALBAC | 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù) | 0.5 pg | ＜2kb | ～93% | 2 | 二代測序、CGH、SNP分型、STR分型、基因克隆、熒光定量 |
三、高通量測序
高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）是測序技術(shù)發(fā)展的一個里程碑，該技術(shù)可以對數(shù)百萬個DNA分子進行同時測序。包括：
- 第二代測序技術(shù)，例如，Roche公司推出的454焦磷酸測序、Illumina公司推出的Solexa/Hiseq聚合酶合成測序和ABI公司推出的SOLiD連接酶測序。該技術(shù)均采用“邊合成邊測序”的測序原理，利用高通量測序技術(shù)對基因組/轉(zhuǎn)錄組進行測序分析，第二代測序技術(shù)因其高通量、高效率和低水平的優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究、生物學(xué)研究和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
- 第三代測序技術(shù)，例如美國Helicos Biosciences公司推出的HeliScope單分子熒光可逆終止技術(shù)、Pacific Bioscience公司推出的單分子實時（single molecule real-time，SMRT）測序技術(shù)和英國牛津納米孔公司推出的單分子納米孔測序技術(shù)（nanopore sequencing）。其中HeliScope單分子熒光可逆終止技術(shù)和SMRT測序技術(shù)均采用的是基于單分子水平上的“邊合成邊測序”；nanopore sequencing采用的是水解測序法。第三代測序技術(shù)不依賴PCR擴增，降低了系統(tǒng)誤差，同時還能檢測特定序列的SNP，測定出稀有突變及其發(fā)生頻率。
四、數(shù)據(jù)分析
在獲得單細胞全基因組測序之后，首先我們需要監(jiān)控read的質(zhì)量剔除低質(zhì)量的reads，然后進行基因組的map工作等，通過矯正由于GC含量引起的誤差之后，通過多種算法尋找基因組當(dāng)中變異類型。
- 目前常見的變異類型有單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入缺失標記（insertion-deletion，InDel）和拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）。
參考文獻
[1] 董燕, 宋程程, 黃鶴. 單細胞測序技術(shù)研究進展[J]. 化學(xué)工業(yè)與工程, 2015, 32(1):71-78.
Li Y , Kim H J , Zheng C , et al. Primase-based whole genome amplification[J]. Nucleic Acids Research, 2008, 36(13):e79-e79.