Flag標(biāo)簽系統(tǒng)是利用DNA重組技術(shù)將一個(gè)短的親水性八肽(DYKDDDDK)融合到目標(biāo)蛋白中，從而形成融合蛋白。Flag標(biāo)簽可位于蛋白質(zhì)的C端或N端，該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。而利用相應(yīng)的Flag標(biāo)簽抗體可對(duì)融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)和純化，并且能夠大大提高目的蛋白的純化效率。

Flag標(biāo)簽

作用原理

  • Flag序列的第二個(gè)氨基酸是酪氨酸(Tyr)，屬于芳香族氨基酸，是影響抗原-抗體特異性反應(yīng)的主要因素；
  • 位于N端帶負(fù)電的天冬氨酸(Asp)可輔助酪氨酸的抗原性；
  • 靠近C端的六個(gè)氨基酸( Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)組成一個(gè)親水序列，能形成高度暴露的三位蛋白質(zhì)構(gòu)型，在理論上可使序列達(dá)到最大的親水性，大大增強(qiáng)了Flag融合標(biāo)簽的抗原性。

Flag標(biāo)簽優(yōu)勢(shì)

  • 序列短小，只用一條人工合成的寡核苷酸鏈就可以編碼；
  • 結(jié)晶條件下Flag融合蛋白的構(gòu)象與單純目的蛋白的構(gòu)象幾乎完全相同，通常不會(huì)與目的蛋白相互作用，并且對(duì)目的蛋白的性質(zhì)和功能影響很小，這樣就有利用研究人員對(duì)融合蛋白進(jìn)行下游研究；
  • 融合有Flag標(biāo)簽的目的蛋白，可以直接通過(guò)Flag標(biāo)簽進(jìn)行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高；
  • 抗Flag的抗體可有效識(shí)別Flag標(biāo)簽，這樣就方便通過(guò) Western blot、ELSA等方法對(duì)含有Flag的融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)、鑒定；
  • Flag融合標(biāo)簽含有一個(gè)腸激酶切割位點(diǎn)，腸激酶可以識(shí)別該短肽C端的五個(gè)氨基酸( Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，通過(guò)腸激酶處理除去標(biāo)簽后即可獲得天然的非融合蛋白質(zhì)。

融合標(biāo)簽的切除

  • ?腸激酶：一般用腸激酶切除融合蛋白結(jié)合在N端的Flag標(biāo)簽。腸激酶可精確識(shí)別DDDDK這5個(gè)氨基酸殘基所組成的序列，F(xiàn)lag標(biāo)簽( DYKDDDDK)內(nèi)部就含有一個(gè)腸激酶切割位點(diǎn)。腸激酶具有活性高、適應(yīng)pH范圍廣的特點(diǎn)，且在多種變性劑和清潔劑濃度下均可進(jìn)行切割，切割后產(chǎn)物不含多余氨基酸。
  • 凝血酶：一種應(yīng)用很廣泛的蛋白酶，主要特點(diǎn)是經(jīng)凝血酶切割后的重組蛋白在切割位點(diǎn)的C端會(huì)保留兩個(gè)氨基酸殘基。凝血酶可以識(shí)別兩種類型的氨基酸序列，分別為X4-X3-P-P[K]-X1?-X2?和X2-R[K]-X1?，凝血酶對(duì)前一種序列的識(shí)別效果更為理想。
  • Xa因子：Xa因子是一種較高效的去除融合標(biāo)簽的工具酶，可特異性識(shí)別I-E[D]-G-R-X1序列，并將融合標(biāo)簽從其C末端切除。

抗Flag標(biāo)簽抗體

目前有3種Flag標(biāo)簽抗體研發(fā)并在市面上投入使用，分別為M1、M2、M5。

  • M1單抗應(yīng)用最早，反應(yīng)的前提是：必須在Ca2+的參與下才能和Flag抗原結(jié)合；只能作用于N末端Flag融合蛋白；要求在N端有自由氨基。
  • M2單抗克服了M1依賴Ca2+的缺陷，避免了螯合劑作用于吸附柱上的抗原-抗體復(fù)合物，且可應(yīng)用于N端Met-Flag和C端Flag融合蛋白質(zhì)。
  • M5單抗不依賴于Ca2+，多應(yīng)用于類似N-Met-Flag-C的序列，對(duì)融合蛋白的親和力非常高，是用于檢測(cè)在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的Flag融合蛋白質(zhì)的首選抗體。

Flag抗體的作用

  • 用于融合蛋白的檢測(cè)和純化：在抗融合標(biāo)簽的單克隆抗體的參與下，可直接通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)( ELISA)、免疫印跡（WB）等方法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)水平；抗融合標(biāo)簽抗體可進(jìn)行相應(yīng)融合蛋白的純化。在抗體和目的蛋白的特異性結(jié)合條件下，蛋白的親和純化效率會(huì)顯著提高。
  • 用于尋找相互作用的蛋白質(zhì)：抗標(biāo)簽的抗體在熒光標(biāo)記后可以用于尋找與融合蛋白相互作用的蛋白質(zhì)(包括目的蛋白的配體或受體)；可利用標(biāo)簽抗體沉淀與目的蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，并通過(guò)進(jìn)一步的分離、純化與鑒定，即可的到與目的蛋白相互作用的蛋白質(zhì)的信息。
  • 用于探索蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能：抗標(biāo)簽抗體可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)分子的功能，特別是用來(lái)研究膜受體的功能，因此，在實(shí)驗(yàn)中可以利用抗標(biāo)簽蛋白抗體的交聯(lián)活化受體，代替天然配體來(lái)研究受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或功能；將標(biāo)簽插入信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的特定結(jié)構(gòu)域還可以用來(lái)研究分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

參考文獻(xiàn)

【1】王云龍，李忠信，李恒思等. Flag標(biāo)簽單克隆抗體的制備、鑒定與應(yīng)用研究 [D]. 2010