高通量測序技術（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序（next generation sequencing，NGS）技術、大規(guī)模平行測序或深度測序技術，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。包括第二代測序技術、第三代測序技術和第四代測序技術。

第二代測序技術

第二代測序技術的核心原理是邊合成邊測序，其與第一代測序技術（Sanger法）相比，具有通量提高、成本降低、周期縮短，敏感性提高、讀長變短等特點。目前具代表性的第二代測序平臺主要有來自Roche公司的454法、Illumina公司的Solexa法和ABI公司的SOLiD法。

Roche 454法

Roche 454（GS-FLX）是一種基于微乳液PCR（Emulsion PCR）和焦磷酸測序技術的測序平臺。其測序原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，GS-FLX系統(tǒng)將引物上每一個dNTP的聚合與一次化學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測DNA序列的目的。

測序流程： 

  1. 文庫制備：將基因組DNA/cDNA打斷成300-800bp長的片段，經(jīng)末端修復與特異性接頭連接修飾后，變性處理，回收單鏈DNA（ssDNA）。
  2. Emulsion PCR：ssDNA與水油包被的磁珠在一起孵育，退火，接頭使成百上千條ssDNA分別結合到磁珠上（磁珠表面含有與接頭互補的寡聚核苷酸序列）（一個DNA片段=一個磁珠），擴增試劑使磁珠乳化，形成油包水的混合物，每個DNA片段在這個混合小滴里進行獨立的擴增，從而實現(xiàn)所有DNA片段的平行擴增（emPCR）。
  3. 焦磷酸測序：經(jīng)過emPCR擴增后，每個DNA片段將被擴增大約100萬倍，預先用Bacillus stearothermophilus聚合酶和單鏈結合蛋白處理帶有DNA片段的磁珠，然后將磁珠被放入Pico Titer Plate板中供（焦磷酸）測序反應使用。

優(yōu)點：

讀取序列長（400 bp）；短耗時；可進行從頭測序（de novo sequence）。

缺點：

焦磷酸測序試劑成本相對較高；樣本制備相對較復雜；無法判斷重復堿基個數(shù)。

Solexa法

Illumina公司的Solexa/Hiseq技術是目前應用最廣泛的二代測序平臺。這兩項技術，都是是基于橋式PCR和熒光可逆終止子的邊合成邊測序（SBS），其測序原理是：可逆終止化學反應，下面介紹了Solexa技術。

測序流程： 

  1. 待測DNA文庫的構建：將待測序列打斷成200-500bp（或更短）的小片段，兩頭用酶補平后，在小片段兩端加上不同的接頭（adapter），連接載體，構建ssDNA文庫。
  2. DNA與流動槽（Flow Cell）的附著：Flow Cell是一種含有8條lane的芯片，每條lane的表面固定有很多（P5’/P7）接頭（引物）。測序時利用微注射系統(tǒng)將已經(jīng)加過（P5/P7）接頭的ssDNA片段隨機添加到Flow Cell內(nèi)，ssDNA片段的P5接頭序列與芯片表面的P5’引物互補，一端被“固定”在芯片上。
  3. 橋式PCR（Bridge PCR）向Flow Cell中添加未標記的dNTP和聚合酶，以ssDNA片段為模板合成出一條全新的DNA鏈（P5’-P7’互補鏈），然后再加入NaOH溶液，使DNA雙鏈解鏈，由于模板鏈沒有結合在lane上，模板鏈會被溶液流洗脫，但互補鏈仍固定在lane上。加入中性緩沖溶液，環(huán)境變成中性后，互補鏈的P7’與lane上P7接頭互補雜交，形成橋型ssDNA，接下來加入dNTP和聚合酶，聚合酶就沿著P7接頭合成出一條新的鏈（橋型ssDNA擴增為橋型dsDNA）。再加入NaOH堿溶液，使DNA雙鏈解鏈，然后再加中和液，繼續(xù)擴增，經(jīng)過不斷的擴增和變性循環(huán)（大約35個循環(huán)）后，最終每種ssDNA都將在各自的位置上集中成束（cluster），每一束都含有單個DNA模板的500-1000個拷貝，從而達到測序所需信號強度的模板量。
  4. 橋式PCR完成之后，再次強堿解鏈，采用一種酶–甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）選擇性的切掉lane上p5‘ 連接的鏈，只留下了與lane p7連接的鏈–Forward Strand。同時。添加ddNTP阻斷延伸。形成cluster測序單元，可直接用于邊合成邊測序反應。
  5. 測序：向反應體系中添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有熒光標記的4種dNTP（可逆終止子：dNTP的3‘羥基被疊氮基團替代，只容許每次添加一個dNTP）。dNTP被添加到合成鏈上之后，將剩余游離dNTP和DNA聚合酶洗脫。然后加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，光學設備記錄熒光信號，計算機分析并將其轉化為測序結果。再加入化學試劑猝滅熒光信號，并使dNTP的3’疊氮基團變成羥基，繼續(xù)進行下一輪測序反應。

優(yōu)點：

高度自動化系統(tǒng)；讀取片段多；適合大量小片段的測序（microRNA、lncRNA等）；高性價比。

缺點：

讀取序列較短；不適于de novo sequence。

SOLiD法

寡聚物連接檢測測序（supported oligo ligation detetion，SOLiD）法是利用DNA連接酶在連接過程中進行測序，其技術核心是：4種熒光標記寡核苷酸的連接反應。

測序流程： 

  1. DNA文庫的構建：將基因組DNA/cDNA進行片段打斷，并在片段兩端加上測序接頭，連接載體，構建ssDNA文庫。
  2. Emulsion PCR：與454技術的Emulsion PCR類似，但磁珠比454小很多，只有1μm。將帶接頭的ssDNA固定在磁珠表面，進行PCR擴增，在擴增的同時對擴增產(chǎn)物進行3’端修飾，3’修飾的磁珠會被沉積在上樣玻片（Slide）上，在上樣過程中沉積小室將每張玻片分成1、2或8個測序區(qū)域。
  3. 連接酶測序：向體系中加入DNA連接酶、通用測序引物n和反應底物-8堿基單鏈熒光探針混合物（3’-XXnnnzzz-5’結構）。探針的5’末端分別標記了CY5、CY3、Texas Red、6-FAM四種顏色的熒光。在這個探針中，第1和第二位（XX）上的堿基是確定的，根據(jù)種類的不同在第6-8位（zzz）上添加了不同的熒光標記。這種由兩個堿基確定一個熒光信號的測序方法被稱為兩堿基測序。當熒光探針與DNA模板鏈配對而連接時，會發(fā)生代表1,2位堿基的熒光信號。記錄下熒光信號后，通過化學方法在第5和第6位堿基之間進行切割，移除熒光信號，以進行下一個位置的測序。通過這種方法，每次測序的位置都相差5位，即第一次測序的位置是第1、2位，第二次測序的位置是第6、7位……在測到末尾后，將新合成的鏈變性，洗脫。然后用通用引物n-1（在引物n的基礎上將測序位置往3’端移動一個堿基，能測定第0、1位和第5、6位）進行第二輪測序。以此類推，再加入n-2、n-3、n-4進行測序，這樣可以完成全部位置的堿基測序，并且每個位置的堿基均被檢測了2次。

優(yōu)點：

高通量；高準確度；可分割測序區(qū)域；系統(tǒng)靈活可以進行樣本的pooling。

缺點：

讀取長度受連接反應限制；一旦在熒光解碼階段發(fā)生錯誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯誤。

第三代測序技術

第三代測序技術的顯著特點是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增，直接進行邊合成邊測序。該技術有兩點是二代測序不具備的：一是直接測RNA的序列，第二個是直接測甲基化的DNA序列。目前具有代表性的第三代測序平臺有美國Helicos Biosciences公司的HeliScope單分子熒光可逆終止技術和Pacific Biosciences公司的單分子實時（single molecule real time，SMAT）測序技術。二者均利用熒光信號進行測序。

HeliScope單分子熒光可逆終止技術

HeliScope單分子熒光可逆終止技術是基于邊合成邊測序的思想，測序過程無需對模板進行擴增，測序原理是：將DNA片段隨機打斷成小片段分別進行dNTP熒光標記，經(jīng)過不斷地重復合成、洗脫、成像、猝滅過程完成測序。

測序流程： 

  1. 將待測序列隨機打斷成小分子DNA片段，在3’末端加上poly(A)，并在poly(A)的末端進行熒光標記和阻斷。
  2. 將待測模板固定到芯片上（通過poly-A尾與固定在芯片上的poly-T雜交），制成測序芯片。
  3. 加入DNA聚合酶和被Cy3熒光標記的脫氧核苷酸進行DNA合成，每一輪反應只加入一種dNTP，然后將未參與合成的DNA聚合酶和dNTP洗脫。
  4. 采集Cy3熒光信號，然后切除熒光標記基團，加入下一種dNTP和DNA聚合酶的混合物，進行下一輪測序反應，如此反復，最終獲得完整的序列信息。

優(yōu)點：

高通量；避免PCR擴增引入錯誤，提高準確率。

缺點：

讀長短；測序成本較高；單讀長的錯誤率偏高，需重復測序以糾正錯誤；儀器非常昂貴。

SMRT

SMRT也是基于邊合成邊測序的思想，該技術以SMRT芯片（一種帶有很多零模波導（Zero-Mode Waveguide，ZMW）孔（納米級）的金屬片）為測序載體。其基本測序原理是：不同熒光標記的4種dNTP，在堿基配對階段，隨堿基加入的不同，會發(fā)出不同熒光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷堿基類型。

測序流程： 

  1. 將DNA聚合酶、待測序序列和被不同熒光標記的dNTP（標記的是磷酸基團而不是堿基）放入ZMW進行合成反應，由于ZMW孔外徑僅100多納米（比檢測激光波長?。す鈴牡撞看蛳氯ズ蟛荒艽┩感】?，進入上方溶液區(qū)，能量均被限制在一個小范圍里，正好能夠覆蓋需要檢測的部分，從而使信號均來自于反應區(qū)域。而孔外未參與合成的dNTP由于未進入檢測區(qū)，則不會發(fā)出熒光。
  2. 當一個被熒光標記的dNTP被加入到合成鏈上的同時，會進入ZMW孔的信號檢測區(qū)，在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光種類可判斷dNTP種類。
  3. 在熒光脈沖結束后，被標記的磷酸基團被切割并釋放，聚合酶轉移到下一個位置，下一個dNTP連接到位點上開始釋放熒光脈沖，繼續(xù)進行下一個循環(huán)。

優(yōu)點：

測序速度快，每秒約10個dNTP；讀長可達幾千個堿基；不需要擴增，原始DNA不被破壞。

缺點：

儀器昂貴，測序成本較高；單讀長的錯誤率偏高；DNA聚合酶在陣列中降解。

第四代測序技術

第四代測序技術又稱“納米孔測序技術”，是近幾年興起的新一代測序技術。另外納米孔測序在國外也被歸納為第三代測序技術。目前市場上廣泛接受的納米孔測序平臺是英國Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的單分子納米孔測序技術（Nanopore sequencing）。

nanopore sequencing

nanopore sequencing是一種基于電信號測序的技術。其測序原理為：當DNA分子在通過納米孔道時，會對通過納米孔的電流或橫穿過納米孔的電流產(chǎn)生影響。不同堿基通過時，對電流產(chǎn)生的影響不同。利用這種差異，nanopore sequencing就可以識別基因中堿基（對）的排列順序。

  • 獨特特點：能夠直接讀取甲基化的胞嘧啶。

測序流程： 

  1. α-溶血素為材料構建生物納米孔，孔內(nèi)共價結合有分子接頭——環(huán)糊精，孔外一側吸附有核酸外切酶。
  2. 將該系統(tǒng)鑲嵌在一個脂雙分子層內(nèi)，為了提供既符合堿基檢測又滿足外切酶活性的物理條件，脂雙分子層兩側應分別設定為不同鹽濃度。
  3. 在適合的電壓下，用核酸外切酶切割ssDNA，被切割下來的單個堿基落入納米孔，并和孔內(nèi)的環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過納米孔的電流強度，每個堿基均因其產(chǎn)生特有的電流干擾振幅而能夠被區(qū)分。
  4. 堿基在納米孔內(nèi)的停留時間是毫秒級的，其解離速率常數(shù)與電壓有關，180mV的電壓即可保證在電信號記錄后將堿基從納米孔中清除。

優(yōu)點：

測序讀長長（超過150kb）；測序速度快；測序數(shù)據(jù)實時監(jiān)控；機器方便攜帶等。

缺點：

采用水解測序法，不能進行重復測序；切斷的核苷酸可能被讀錯方向；難于生產(chǎn)出帶多重平行孔的裝置，通量較小。

高通量測序技術的應用

  • 轉錄組測序：研究細胞表現(xiàn)和功能
  • 甲基化測序：表觀遺傳學標記信息
  • 外顯子組測序：研究定向富集的DNA
  • 染色質(zhì)免疫沉淀-深度測序（ChIP-seq）
  • 基因組測序等。