自20世紀(jì)70年代中期融合標(biāo)簽技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，親和標(biāo)簽已成為一種重組蛋白純化十分有效的工具，具有結(jié)合特性高、純化條件溫和、純化步驟簡(jiǎn)單、適用性廣泛等顯著優(yōu)勢(shì)。目前為止已出現(xiàn)了種類眾多，功能各異、用途多樣的親和標(biāo)簽，極大的促進(jìn)了重組蛋白的有效純化。

常用親和標(biāo)簽列表

類型	大?。↘Da）	殘基數(shù)	序列
Flag-tag	1.01	8	DYKDDDDK
6*His-tag	0.84	2~10（通常6個(gè)）	HHHHHH
HA-tag	1.10	9	YPYDVPDYA
GST-tag	26.00	211	蛋白質(zhì)
c-myc-tag	1.20	10	EQKLISEEDL
SPA-tag	12.00~13.00	116	蛋白質(zhì)
S-tag	1.75	15	KETAAAKFERQHMDS
Arg-tag	0.80	5~6（通常5個(gè)）	RRRRR
Strep-tag Ⅱ	1	8	WSHPQFEK
CBP	4	26	KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL

親和標(biāo)簽分類

根據(jù)自身分子量大小的不同可分為兩類：① 一類為大的蛋白質(zhì)分子如GST-tag、SPA-tag、GFP-tag等。使用時(shí)會(huì)增加目標(biāo)蛋白的溶解性，但在蛋白結(jié)晶和抗體生產(chǎn)的過(guò)程中，標(biāo)簽必須去除。

②另一類為小的多肽標(biāo)簽如6*His-tag、HA-tag、c-myc tag等。多數(shù)情況下由于多肽標(biāo)簽相對(duì)較小，對(duì)融合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小，不需要從融合蛋白質(zhì)中切除，因而多肽標(biāo)簽較蛋白質(zhì)標(biāo)簽更為常用。

常用親和標(biāo)簽

Flag-tag

Flag標(biāo)簽是由八個(gè)親水氨基酸（DYKDDDDK）組成的一個(gè)短肽，分子量很小，因此不會(huì)遮蓋融合蛋白中其他蛋白表位與結(jié)構(gòu)域。該標(biāo)簽具有天然的親水特性，可位于蛋白質(zhì)的C端或N端，利于抗體檢測(cè)，同時(shí)含有一個(gè)腸激酶切割位點(diǎn)，可通過(guò)腸激酶切除標(biāo)簽。

His-tag

His-tag由人工合成的組氨酸首尾相連構(gòu)成，通常由6個(gè)氨基酸（HHHHHH）組成，也有3個(gè)和8個(gè)的情況。His融合標(biāo)簽與其他標(biāo)簽相比有很多明顯優(yōu)勢(shì)，是目前用于純化的融合標(biāo)簽中使用最為廣泛的一種。His標(biāo)簽融合蛋白一般采用固定化金屬離子親和層析進(jìn)行分離純化，操作較為簡(jiǎn)便。

StrepⅡ-tag

StrepⅡ即鏈霉親和素結(jié)合肽，是一個(gè)小分子的短肽標(biāo)簽，由8個(gè)氨基酸（WSHPQFEK）組成，可位于融合蛋白的任一位置。廣泛應(yīng)用于多種目標(biāo)蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)等的純化。

GST-tag

GST即谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，具有解毒作用，可將谷胱甘肽中的硫基轉(zhuǎn)移至含硝基或鹵化物的復(fù)合物中。其天然大小為26KD。近年來(lái)，商品化的GST融合蛋白表達(dá)體系以及GST標(biāo)簽抗體系統(tǒng)至今仍被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)在原核表達(dá)體系中，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶GST表達(dá)純化系統(tǒng)的應(yīng)用更為普遍。

HA-tag

HA標(biāo)簽蛋白，標(biāo)簽序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的紅細(xì)胞凝集素表面抗原決定簇，9個(gè)氨基酸，對(duì)外源靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響小，容易構(gòu)建成標(biāo)簽蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti-HA抗體檢測(cè)和ELISA檢測(cè)。

C-myc-tag

c-myc 標(biāo)簽蛋白，是含11個(gè)氨基酸的小標(biāo)簽，標(biāo)簽序列Glu- Gln-Lys-Leu-lle-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個(gè)氨基酸作為抗原表位，表達(dá)在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可識(shí)別其相應(yīng)抗體。 C-Myc tag已成功應(yīng)用在 Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中，可用于檢測(cè)重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)。

MBP-tag

MBP-tag（麥芽糖結(jié)合蛋白）是由大腸桿菌K12的maLE基因編碼的396個(gè)氨基酸組成，大小為40KDa，同GST標(biāo)簽一樣，MBP標(biāo)簽?zāi)茉龃笕诤系鞍卓扇苄?，提高其表達(dá)產(chǎn)量。

eGFP-tag

eGFP標(biāo)簽蛋白，是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。eGFP激發(fā)波長(zhǎng)為488m，發(fā)射波長(zhǎng)為507nm，是由野生型綠色熒光蛋白GFP通過(guò)氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來(lái)的。相對(duì)于GFP，eGFP熒光強(qiáng)度更強(qiáng)、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。同時(shí)載體中構(gòu)建的KOza K序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。

Avi-tag

Avi-tag是由15個(gè)氨基酸組成的短肽，具有一個(gè)單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，與已知天然可生物素化序列完全不同。Avi-tag加在目標(biāo)蛋白的N端和C端融合表達(dá)后，可被生物素連接酶生物素化，可用于蛋白質(zhì)分離純化及蛋白質(zhì)相互作用研究。

Profinity eXact tag

Profinity eXact標(biāo)簽是由野生型枯草芽孢桿菌蛋白酶BPN’的功能前域，經(jīng)基因改造而得到的大小約為8.2kDa的一段多肽。利用基因工程的方法對(duì)該功能域進(jìn)行改造，提高其穩(wěn)定性，使其含有一段枯草桿菌蛋白酶突變體S189的剪切識(shí)別序列（EEDKLFKAL）。由此發(fā)展的Profinity eXact親和純化技術(shù)越來(lái)越多的應(yīng)用于重組蛋白的分離純化實(shí)驗(yàn)中。

IMPACT System

內(nèi)含肽（inteins）是前體蛋白中自然發(fā)生的一段蛋白序列，能夠在翻譯后自我催化蛋白質(zhì)的剪接，使得自身從前體蛋白中切除。根據(jù)內(nèi)含肽自我剪接的特性，將常規(guī)的親和標(biāo)簽與自我剪切的內(nèi)含肽有機(jī)結(jié)合，形成了新穎的自我剪切親和標(biāo)簽。在實(shí)驗(yàn)時(shí)能同時(shí)達(dá)到蛋白純化與標(biāo)簽去除的雙重目的，不僅具有了親和純化的高度特異性，并且免去了去除標(biāo)簽的繁瑣步驟，目前已成功用于多種重組蛋白的分離純化中。

PHB System

PHB，即聚羥基丁酯，是一種由多種微生物產(chǎn)生的可生物降解的聚合物。研究發(fā)現(xiàn)，小分子蛋白phasins對(duì)PHB顆粒有很強(qiáng)的特異性親和力，因此將phasins作為親和標(biāo)簽，構(gòu)建“phasins-內(nèi)含肽-目標(biāo)蛋白”的融合蛋白，與PHB顆粒一起在含有兩個(gè)質(zhì)粒的表達(dá)宿主中共表達(dá)，最終也可回收到較高純度的無(wú)標(biāo)簽?zāi)康牡鞍住?/p>

ELP System

ELP，即彈性蛋白樣多肽，一般由5個(gè)氨基酸VPGXG組成的基序多次重復(fù)構(gòu)成，其中X可以是除了脯氨酸之外的任一氨基酸。ELP由于其獨(dú)特的熱誘導(dǎo)相變性質(zhì)，可將ELP作為純化標(biāo)簽，構(gòu)建形式為“ELP-內(nèi)含肽-目標(biāo)蛋白”的融合標(biāo)簽并在大腸桿菌中大量表達(dá)，最終能得到較高純度且無(wú)標(biāo)簽的水溶性目標(biāo)蛋白。

親和標(biāo)簽的組合使用

His₆-MBP組合標(biāo)簽

His₆-MBP組合標(biāo)簽是目前普遍常用的一種親和標(biāo)簽組合方式。在此組合中，融合蛋白的形式為“His₆-MBP-目標(biāo)蛋白”，其中His標(biāo)簽用于融合蛋白的親和純化，MBP部分能夠增大目標(biāo)蛋白的可溶性，提高蛋白產(chǎn)量，His₆-MBP與目的蛋白之間加入一段煙草蝕紋病毒蛋白酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)的標(biāo)簽去除。

串聯(lián)親和純化

該技術(shù)方法主要研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。通過(guò)在目標(biāo)蛋白的一端嵌入一個(gè)特殊的蛋白標(biāo)簽（如TAP標(biāo)簽），不破壞目標(biāo)蛋白的調(diào)控序列，經(jīng)過(guò)連續(xù)兩步的親和層析獲得接近自然生理?xiàng)l件下的特定蛋白質(zhì)復(fù)合體，然后用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)。該技術(shù)既吸收了親和純化得到高純度低拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)復(fù)合體，也繼承了免疫共沉淀中運(yùn)用特異性的標(biāo)記蛋白與親和層析柱之間的相互作用，可快速得到獲得生理?xiàng)l件下與目的蛋白存在真實(shí)作用的蛋白質(zhì)。

親和標(biāo)簽的作用

①蛋白質(zhì)的純化

融合標(biāo)簽技術(shù)已廣泛用于重組蛋白質(zhì)的純化。通過(guò)融合蛋白中攜帶的標(biāo)簽，產(chǎn)物僅需一步親和層析就可獲得有效的純化，純化后產(chǎn)物進(jìn)一步利用化學(xué)方法或特異性的蛋白酶切割，即可得到純度高、質(zhì)量好的目的蛋白。目前較常用的蛋白純化標(biāo)簽有FLAG，GST和His標(biāo)簽，不僅僅這些標(biāo)簽本身可用于蛋白的純化，其相對(duì)應(yīng)的單抗或多抗也被應(yīng)用于融合蛋白的純化。

②蛋白質(zhì)的固定與檢測(cè)

闡明蛋白質(zhì)之間相互作用，描繪出蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容。進(jìn)入到后蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代后，對(duì)蛋白質(zhì)的研究也相應(yīng)變的更加細(xì)化。生物芯片技術(shù)是一種很成熟的技術(shù)平臺(tái)，用以研究蛋白質(zhì)之間相互作用。其主要原理就是將某些生物分子，如蛋白質(zhì)或核酸等，固定在固相基質(zhì)上，利用標(biāo)簽蛋白與配基間的特異性吸附作用很好的將蛋白固定在固相載體表面。這些標(biāo)簽蛋白起到了一種間隔臂的作用，大大降低目的蛋白與固相基質(zhì)直接接觸的幾率。與此同時(shí)，位于融合蛋白質(zhì)N端或C端的融合標(biāo)簽，將目標(biāo)蛋白的活性中心充分暴露，可形成均質(zhì)配基表面，其對(duì)于生物芯片以及基于表面等離子體共振原理的 BLAcore系統(tǒng)發(fā)揮作用非常關(guān)鍵。

③提高蛋白產(chǎn)量及增加可溶性

對(duì)于宿主菌來(lái)說(shuō)，外源蛋白質(zhì)具有異質(zhì)性。故這些外源蛋白在宿主菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，宿主菌會(huì)通過(guò)各種機(jī)制來(lái)阻止其過(guò)量表達(dá)，可導(dǎo)致我們所需要的目的蛋白表達(dá)量降低。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，融合標(biāo)簽的加入可有效的解決這種問(wèn)題，使重組蛋白的產(chǎn)量增加。

外源蛋白質(zhì)在宿主菌內(nèi)表達(dá)時(shí)大多以包涵體的形式存在，使天然蛋白質(zhì)的活性大大降低。研究發(fā)現(xiàn)一些高度可溶的蛋白質(zhì)(如MBP等標(biāo)簽蛋白)在與其它蛋白融合后會(huì)促進(jìn)融合蛋白質(zhì)以可溶形式表達(dá)。如SET-tag，其可增強(qiáng)融合蛋白的可溶性表達(dá)，該標(biāo)簽以靜電排斥來(lái)防止新生多肽相互聚集。