抗體經(jīng)制備后需要進(jìn)一步純化,純的抗體有利于保存以及排除雜蛋白對(duì)結(jié)果的影響。抗體純化方法的選擇一般取決于抗體的來(lái)源、時(shí)間的需求、成本的預(yù)算以及抗體的最終用途等。

根據(jù)純化方式可分為以下幾類(lèi):

親和層析法

親和層析主要適用于從成分復(fù)雜且雜質(zhì)含量遠(yuǎn)大于目標(biāo)物的混合物中提純目標(biāo)物。如圖所示,瓊脂糖首先與介質(zhì)偶聯(lián),結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì),再加入成分復(fù)雜的混合物即樣品后,配體選擇性吸附生物活性物質(zhì)(高親和力抗體),加入平衡液,洗脫去除雜質(zhì),最終獲得目標(biāo)物。

protein A/protein G親和層析

通過(guò)基因工程改造的protein A和protein G能特異性結(jié)合哺乳動(dòng)物IgG的Fc區(qū)段, 將protein A和protein G結(jié)合到柱料上,通過(guò)親和層析的方式,可將IgG及其亞類(lèi)與片段純化出來(lái)。

● protein A:分子量為42kDa,由spa基因編碼,具有5個(gè)同型的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域由3個(gè)α螺旋構(gòu)成。

Protein A的各個(gè)結(jié)構(gòu)域

● protein G:分子量為65kDa,由spg基因編碼,可結(jié)合抗體的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白?;蚬こ谈脑斓膒rotein G去掉了與白蛋白的結(jié)合位點(diǎn),僅保留Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其結(jié)合力較protein A更強(qiáng)。

Protein G的各個(gè)結(jié)構(gòu)域

● protein A/protein G:是一種基因工程結(jié)合蛋白。它由4個(gè)protein A和2個(gè)protein G免疫球蛋白結(jié)合域組成,比單獨(dú)的protein A或protein G結(jié)合范圍更加廣泛,并將其優(yōu)點(diǎn)融為一體,幾乎可以應(yīng)用于所有種屬的IgG純化。

抗原親和純化法

利用抗原為配體的親和純化稱(chēng)之為抗原親和純化,是一種高度純化蛋白類(lèi)生物大分子的有效手段。此種方法中,抗原替代親和配體,被化學(xué)偶聯(lián)在凝膠介質(zhì)上,目的抗體與抗原特異性結(jié)合,最終洗脫得到目的抗體。

與protein A純化法的區(qū)別在于,抗原親和純化是與抗體的Fv區(qū)特異性結(jié)合,protein A純化則與抗體的Fc區(qū)特異性結(jié)合。相比較之下抗原親和純化能高度識(shí)別和結(jié)合目標(biāo)抗體,因此常用于多抗的純化。

硫酸銨沉淀

硫酸銨沉淀經(jīng)常用于富集和濃縮來(lái)自血清、腹水或細(xì)胞培養(yǎng)上清液的抗體。隨著樣品中該溶質(zhì)鹽的濃度增加,蛋白質(zhì)和其他大分子逐漸變得不易溶解,直至它們沉淀出來(lái)。與大多數(shù)其他蛋白質(zhì)和血清成分相比,抗體在較低濃度的硫酸銨中沉淀。當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到40%至50%(100%飽和度等于4.32M)時(shí),免疫球蛋白會(huì)沉淀而其他蛋白質(zhì)保留在溶液中。

通常的方法是將非等量的飽和硫酸銨溶液非常緩慢地加入到中和的抗體樣品中,然后在室溫或4℃下孵育數(shù)小時(shí),離心并除去上清液后,將抗體沉淀溶解在緩沖液中,如磷酸緩沖液(PBS)。

疏水作用層析法

利用鹽-水體系中樣品分子的疏水基團(tuán)和層析介質(zhì)的疏水配基之間疏水力的不同而進(jìn)行分離的一種層析方法。這種方法利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū),變形后暴露出的疏水殘基,或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強(qiáng)弱,依次用從高到低的離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水作用由弱至強(qiáng)的組分分離。

離子交換法

離子交換層析法是從復(fù)雜的混合物中,分離性質(zhì)相似大分子的方法之一。由于蛋白質(zhì)有等電點(diǎn),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的PH條件下,其帶電狀況也不同。陽(yáng)離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì),所以這類(lèi)蛋白質(zhì)被留在柱子上,然后通過(guò)提高洗脫液中的鹽濃度等措施,將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來(lái)。同樣,陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì),結(jié)合的蛋白可以通過(guò)逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的PH值洗脫下來(lái)。

尺寸排阻色譜法

尺寸排阻色譜法又稱(chēng)為分子排阻色譜法(SEC),主要根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團(tuán)尺寸間的相對(duì)關(guān)系而對(duì)溶質(zhì)進(jìn)行分離的分析方法。主要用于分離分子量相差大的化合物。

原理:取決于分子在溶液中的體積,當(dāng)溶液加入純化柱時(shí),分子會(huì)依照其在溶液中的尺寸(分子平均直徑)從大到小依次分離。分子小的通過(guò)柱床流動(dòng)速度相對(duì)緩慢,因?yàn)樗鼈儠?huì)不同程度的深入孔隙,而大的分子由于不能進(jìn)入柱床而被快速排出,因此,通過(guò)分子體積大小洗脫樣品,可以有效進(jìn)行分選。