抗血清是一種含有高效價(jià)特異性抗體的血清，一般為動(dòng)物被人工注射某類抗原后制備的動(dòng)物血清。通過注射抗血清可以傳遞被動(dòng)免疫治療許多疾病。
抗血清制備原理：
將抗原注射于動(dòng)物體，將引起免疫應(yīng)答?？纱碳?dòng)物的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生特異性抗體，待血清中積累大量抗體時(shí)，采集動(dòng)物血液并分離析出血清，此即含抗體的免疫血清（抗血清）?？寡灏辜?xì)菌、抗毒素、抗病毒血清。
抗血清制備步驟：
1、選擇免疫動(dòng)物
- 免疫動(dòng)物一般選擇青壯年期、健壯雌性個(gè)體。
- 抗原與免疫動(dòng)物的種屬差異越遠(yuǎn)越好。
- 針對(duì)不同性質(zhì)的免疫原選擇相應(yīng)的動(dòng)物。
- 制備H血清用馬，制備R血清用兔，制備補(bǔ)體用豚鼠血清。
２、抗原制備
- 抗原劑量：用滅菌生理鹽水將抗原稀釋為2mg/mL，與佐劑混合制成乳劑后用于動(dòng)物免疫。
- 免疫原的注射劑量應(yīng)考慮其抗原性的強(qiáng)弱、分子量大小、動(dòng)物的個(gè)體狀態(tài)和免疫時(shí)間。通常小鼠首次抗原劑量為50～100μg/次，大鼠為100～200μg/次，兔為100～1mg/次，合成免疫原為2mg（半抗原約為20～200μg），一般需要與等量的福氏完全佐劑混合。加強(qiáng)免疫原與福氏不完全佐劑混合或不用免疫佐劑，劑量為首次計(jì)量的1/2。
- 抗原乳劑的配制：將等量的佐劑與抗原溶液倒入缽內(nèi)，經(jīng)過反復(fù)碾磨，形成油包水乳劑。制成的油包水乳劑直接影響免疫效果，因此使用前需進(jìn)行質(zhì)量檢查。檢查方法是將制成的乳劑滴一滴在自來水表面，質(zhì)量合格的乳劑滴入水面保持滴珠完整不分散，不合格的乳劑立即擴(kuò)散，水面油亦逐漸擴(kuò)大。若檢查不合格，則須繼續(xù)操作至質(zhì)量合格為止。
３、確定免疫方案
- 根據(jù)免疫目的的要求、抗原性質(zhì)、佐劑種類來制定免疫方案?？刹捎萌棵庖叻?、微量免疫法或混合免疫法。免疫接種途徑通常有靜脈、腹腔、肌肉、皮下、淋巴結(jié)等接種途徑，對(duì)抗原的吸收速度為靜脈=腹腔=淋巴結(jié)＞肌肉＞皮下＞皮內(nèi)。若抗原寶貴可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射法；半抗原宜皮內(nèi)多點(diǎn)注射。免疫接種劑量應(yīng)根據(jù)分子量大小、免疫原性強(qiáng)弱、動(dòng)物個(gè)體狀態(tài)和免疫時(shí)間決定。
- 免疫間隔時(shí)間：第一次與第二次免疫的時(shí)間間隔一般以10～20天為佳，二次以后間隔時(shí)間一般為7～10天。
４、免疫動(dòng)物（常規(guī)免疫方法–皮內(nèi)多點(diǎn)注射）
- 第一次免疫：劑量為每只兔子注射1.0mL抗原乳劑（含抗原量1～2mg）。注射部位為兩只后腳掌的皮內(nèi)各注射0.2mL，其余0.6mL分多點(diǎn)注入脊椎二側(cè)、頸部、腹股溝和腋窩等處淋巴結(jié)附近部位皮內(nèi)，每點(diǎn)可注入0.05mL，分12次注入。
- 第二次免疫：初次免疫后20天左右，劑量為1.0mL/只，加福氏不完全佐劑。注射部位在腹部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注入0.1mL。
- 第三次免疫：二次免疫7～10天后，注射部位和劑量同第二次免疫。
- 試血：末次免疫5～7d后，抽取少許靜脈血，分離血清后進(jìn)行試血。采用免疫雙擴(kuò)散法測(cè)定效價(jià)在1:16以上即可放血，若效價(jià)較低，可繼續(xù)加強(qiáng)免疫。
５、采血分離血清
- 放血：放血前動(dòng)物應(yīng)停食12h，如擬保留該免疫動(dòng)物，可直接由心臟取血或切開耳緣靜脈滴血或心臟穿刺取血。取血后由靜脈緩緩注入等量5%葡萄糖溶液以補(bǔ)充失血量。取血的動(dòng)物經(jīng)2～3個(gè)月休息，可再次加強(qiáng)免疫后取血；如擬一次放血致死，可用頸動(dòng)脈放血的方法。
- 分離血清：在無菌條件下，待血液自然凝固后，靜置4℃冰箱，待血清析出后，經(jīng)離心沉淀分出血清。
6、抗血清的鑒定與保存
- 抗體特異性鑒定：鑒定方法常采用雙向免疫瓊脂擴(kuò)散技術(shù)。
- 血清抗體效價(jià)測(cè)定：測(cè)定方法常用的是放射免疫法和免疫雙擴(kuò)散法。
- 抗體純度鑒定：采用SDS-PAGE法進(jìn)行純度鑒定。
- 抗血清的純化：常見的純化方法是提取特異性IgG。特異性IgG抗血清制備：首先用硫酸銨或硫酸鈉鹽析法粗提丙種球蛋白，再進(jìn)一步純化。粗提法提取γ球蛋白：采用硫酸銨鹽析法或硫酸鈉鹽析法，硫酸銨鹽析法須經(jīng)多次沉淀，經(jīng)三次提取后的γ球蛋白大多屬于IgG。
- 抗血清的保存：將鑒定合格后的抗血清，以1:100的比例加入1%的硫柳汞或5%的疊氮鈉，使其最后濃度分別為0.01%或0.05%。用無菌滴管將抗血清分裝小管，每管裝約1mL，置于4℃保存，可保存3個(gè)月～6個(gè)月；-70℃～-20℃保存可保存2～3年；真空冰凍干燥保存，可保存4～5年。
實(shí)驗(yàn)流程圖
主要儀器試劑
- 抗原與免疫對(duì)象：抗原、健康家兔。
- 試劑：生理鹽水、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、注射器、石炭酸、防腐劑(1%的硫柳汞或5%的疊氮鈉)等。
- 設(shè)備與器材：剪刀、鑷子、注射器等器材和冰箱、離心機(jī)等設(shè)備。
注意事項(xiàng)：
- 動(dòng)物的免疫反應(yīng)存在個(gè)體差異，因此制備血清時(shí)，應(yīng)同時(shí)免疫3～4只。
- 為制備單價(jià)特異性高的抗血清，所用抗原純度越高越好，因此在純化抗原過程中應(yīng)盡可能除去可能存在的雜蛋白。
- 要制備高效價(jià)的抗體，必須要加佐劑，但若抗原中存在雜蛋白，則可能因佐劑的存在而產(chǎn)生非特異性的抗體，所以要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和抗原的純度適當(dāng)?shù)厥褂米魟?/li>
- 制成的抗原乳劑是否為油包水乳劑應(yīng)進(jìn)行檢查，否則會(huì)影響免疫效果，若不是油包水乳劑，應(yīng)重新制備。
- 當(dāng)抗原量過少不易提純時(shí)，可采用抗原抗體在瓊脂擴(kuò)散中形成的沉淀線直接免疫動(dòng)物制備抗體。
- 抗血清效價(jià)一般以抗血清稀釋倍數(shù)表示。血清效價(jià)檢測(cè)方法很多，靈敏度各不同，在表示抗血清效價(jià)時(shí)，應(yīng)注意標(biāo)明檢測(cè)方法。
- 分裝保存的抗血清應(yīng)標(biāo)明抗血清的名稱、效價(jià)、制備日期以及包裝量。
抗血清的應(yīng)用
- 疾病的緊急預(yù)防與治療：當(dāng)動(dòng)物接種相應(yīng)抗血清后，機(jī)體迅速得到大量非自身免疫抗體，從而快速中和侵入人體的病原，如抗豬瘟血清能有效控制豬瘟的疫情，抗犬瘟熱血清對(duì)犬瘟熱有獨(dú)特的療效。
- 疾病診斷和病原鑒定：血清學(xué)診斷方法在疾病診斷和病原鑒定中具有十分重要的地位，其中采用高效價(jià)特性的抗血清（陽性血清）作為反應(yīng)的診斷物是血清學(xué)診斷方法的重點(diǎn)。如口蹄疫細(xì)胞中和試驗(yàn)性血清、日本血吸蟲病凝集試驗(yàn)陽性血清、衣原體病間接血凝試驗(yàn)陽性血清等。
- 抗血清還可用于微生物的鑒定、抗原的分析、免疫球蛋白的鑒定以及其他蛋白質(zhì)的鑒定與研究。