GFP（綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)極大地推動了現(xiàn)代生物學的發(fā)展，應用前景廣闊?；谛滦凸δ軣晒獾鞍祝ㄈ绻饧せ顭晒獾鞍缀凸廪D(zhuǎn)換熒光蛋白和氧化還原敏感的GFP等）的光學分子成像技術(shù)的發(fā)展，為在活細胞乃至活體動物內(nèi)研究基因表達和蛋白質(zhì)功能提供了更多的選擇空間。

GFP在干細胞移植領(lǐng)域的應用

目前，常用的綠色熒光蛋白標記干細胞的方式有3?種：質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染、病毒載體轉(zhuǎn)染和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動物。

  • 綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有操作簡便、對干細胞的免疫源性和毒性小等優(yōu)點，但不十分穩(wěn)定，容易丟失；
  • 病毒載體的優(yōu)勢是表達高效穩(wěn)定，但存在免疫反應和致癌性等安全隱患；
  • 從綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動物分離得到的干細胞標記穩(wěn)定，是理想的選擇。綠色熒光蛋白標記的干細胞移植后在體內(nèi)的分布情況可在熒光顯微鏡下直接觀察到，結(jié)合使用定量聚合酶鏈反應、激光共聚焦和熒光激活細胞分類計數(shù)等技術(shù)方法，還可監(jiān)測移植干細胞在體內(nèi)的分化增生情況以及其在各組織的含量等。

GFP在細胞生物學中的應用

GFP具有同宿主蛋白構(gòu)成融合子的性質(zhì)，利用這一性質(zhì)，可以將GFP定位到特定的細胞器和膜系統(tǒng)中，進行細胞生理過程、細胞動力學等的實時觀測，或直接應用于定量分析。目前，GFP已經(jīng)被成功地用于靶向標記包括細胞核、線粒體、質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等在內(nèi)的細胞器。用GFP進行亞細胞定位，避免了提純蛋白、標記異硫氰酸熒光素等熒光染料、經(jīng)顯微注射或其他方式導入細胞的復雜方法，從而使研究蛋白在活細胞的準確定位變得簡單易行。

GFP在分子生物學研究中的應用

在生物學研究中的應用

GFP作為標記分子，目前已被廣泛應用于基因標記、蛋白質(zhì)標記、環(huán)境微生物研究、寄生蟲學研究以及發(fā)育生物學研究中基因表達模式的探索等方面，成為活細胞分子水平研究的工具。

在生態(tài)學上的應用

  • GFP在生態(tài)學中的應用將GFP基因直接導入目標生物或?qū)FP基因克隆到病毒、細菌或質(zhì)粒上，通過它們的介導而間接標記目標生物，進行生態(tài)學規(guī)律研究。
  • 用GFP基因標記遺傳工程微生物以檢測其在水環(huán)境中的存活和去向。
  • 跟蹤觀察微生物。

在醫(yī)學研究中的應用

  • 利用GFP示蹤證實了脂肪來源的干細胞的分化方向和分化能力；利用增強型GFP篩選合適的生物材料； GFP還用于細胞因子作用的研究以及活體動態(tài)觀察的研究。
  • GFP廣泛應用于視網(wǎng)膜的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、目的基因的調(diào)控及感光細胞凋亡保護的研究。
  • 在免疫學治療方面，應用GFP作為表皮生長因子受體研究的工具，并對第二信使蛋白進行亞細胞定位，這既可以揭示其在活細胞內(nèi)作用，又可以觀察一些抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑等信號傳導抑制藥物的作用效應。

GFP作為報告基因

GFP作為報告基因可用來檢測轉(zhuǎn)基因效率，把GFP基因連接到目的基因的啟動子之后，通過測定GFP的熒光強度就可以對該基因的表達水平進行檢測。目前，此方法無論在農(nóng)桿菌介導或基因槍介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化中還是在活細胞、轉(zhuǎn)基因胚胎和動物中都已得到非常廣泛的應用，特別是在活細胞基因表達的時空成像方面。

GFP作為融合標簽

GFP最成功的一類應用就是把GFP作為標簽融合到主體蛋白中來檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子間的相互作用，或者靶向標記某些細胞器。在多數(shù)情況下，GFP基因在N-或C-末端與異源基因用常規(guī)的分子生物學手段就可以結(jié)合構(gòu)成編碼融合蛋白的嵌合基因，其表達產(chǎn)物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現(xiàn)出與天然GFP相似的熒光特性。GFP的這種特性為蛋白質(zhì)提供了一種熒光標記，不僅可以檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移，還可以研究蛋白質(zhì)分子的相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，并依靠熒光共振能量轉(zhuǎn)移來進行檢測。

其他應用

  • 野生型GFP和其許多突變體可以作為生物傳感器檢測活細胞內(nèi)的pH。
  • GFP還可以應用于檢測電位、氧化還原水平以及在信號轉(zhuǎn)導中作為Ca2+指示劑。
  • GFP廣泛應用于細胞篩選和藥物篩選 。
  • 通過定點突變、DNA-shuffling?等技術(shù)對GFP進行了改進，獲得了熒光光譜、量子產(chǎn)率、溶解性、密碼子嗜性、溫度敏感性等改變的多種突變體，擴大了GFP的應用范圍。