免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的，用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。
當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
免疫沉淀
利用抗原抗體特異性結(jié)合，在含有目的抗原的細胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A-Beads ，根據(jù)抗原與抗體、Protein A與抗體的FC的特異性，形成“抗原-抗體-Protein A-Beads”的復合物，清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白，得到目的蛋白之后，用SDS-PAGE和Western blot進行驗證。
免疫共沉淀
基于免疫沉淀的反應，捕獲和純化靶蛋白（即抗原）以及樣品溶液中與靶蛋白天然相互作用結(jié)合的其他大分子。因此實驗屬于IP還是Co-IP取決于實驗的目的是目的抗原還是相互作用大分子。
免疫共沉淀實驗的優(yōu)化
免疫共沉淀的操作方法較為簡單，但由于生理狀態(tài)下蛋白間的相互作用 可能存在非特異性結(jié)合，或是存在抗體的污染，因此有以下幾個方面可以進行優(yōu)化。
裂解和洗滌緩沖液
裂解和洗滌緩沖液是維持復合物形成的關(guān)鍵因素。使用標準非變性裂解緩沖液裂解，許多蛋白間的相互作用將保持完整。含有非離子型洗滌劑的低離子強度緩沖液（即<120mM NaCl）不太可能破壞蛋白間的相互作用。另外應避免在洗滌期間用超聲或渦旋處理的方法裂解細胞、裂解物或珠子結(jié)合的免疫復合物，以防止破壞復合物間的相互作用。離心過程中應輕柔處理樣品以確保減少復合物的損失。
固相支持物的選擇
用于免疫共沉淀的固相支持物一般有瓊脂糖珠和磁珠兩種。瓊脂糖珠由于其多孔表面通常具有更高的結(jié)合能力，磁珠能提供諸如易于使用，更低的非特異性結(jié)合和與自動化的兼容性等優(yōu)點。更多的比較可以詳見免疫沉淀技術(shù)頁面。
非特異性作用的高背景
由于細胞裂解物中存在大量蛋白質(zhì)，因此在操作過程中可能會發(fā)生與目標復合物的非特異性結(jié)合。這些非特異性相互作用一般通過徹底清洗珠子結(jié)合的免疫復合物來打破，但也可以應用其他策略來優(yōu)化非特異性結(jié)合，例如：
- 通過將鹽濃度從120mM滴定至1000mM來改變緩沖液的離子強度
- 減少一抗的使用量，直到信號干擾比最大化
- 預清除裂解物
抗體污染的解決
免疫共沉淀常遇到的問題是在凝膠分析期間來自抗體條帶的干擾。在沉淀的樣品中可能會存在抗體輕鏈（25KD）和重鏈（50KD）的干擾。針對這種情況可以采用以下幾種方法進行優(yōu)化：
- 運用交聯(lián)劑將抗體和Protein A-Beads交聯(lián)，通過添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體- Protein A-beads復合物，最后離心去除抗體-Protein A-beads復合物，上清中只留下目的蛋白
- 利用生物素化抗體和鏈霉親和素微珠直接偶聯(lián)。免疫復合物被珠子捕獲，并且因為生物素與鏈霉抗生物素蛋白強烈結(jié)合，當使用溫和條件釋放靶抗原時抗體不會從珠子上洗脫
- 將常用的融合標簽摻入用于Co-IP主要靶蛋白中時，預固定的抗融合標簽抗體可用于蛋白質(zhì)復合物純化
如何評估蛋白間的相互作用
在檢測蛋白間的相互作用時，需要判斷檢測是真正的生理相互作用還是由于方案原因?qū)е庐a(chǎn)生的相互作用。以下是幾種判斷標準：
驗證抗體特異性
- 通過免疫沉淀來進行抗體驗證，然后進行質(zhì)譜分析，也可以識別先前已知的蛋白間的相互作用
- 根據(jù)已知特異性結(jié)合靶蛋白的充分表征的抗體，來確定檢測到的蛋白相互作用中的靶蛋白可以從樣品中被沉淀。在測試未表征的抗體時，應設置對照以顯示使用測試抗體可以從純化蛋白質(zhì)的原液中沉淀靶蛋白
即使是高質(zhì)量的單克隆抗體也可能與非特異性蛋白結(jié)合，因此在實驗時盡可能使用與一抗相匹配的對照抗體。
驗證功能交互
許多蛋白間的相互作用依賴于復合物中一種或多種結(jié)合配偶體的活化。因此為了測試是否發(fā)生真正的相互作用，表達其中一個結(jié)合配偶體的無活性變體的細胞可用于蛋白質(zhì)復合物的Co-IP。如果需要活化，則復合物不會與靶抗原發(fā)生共沉淀。
確認生理相互作用
細胞裂解導致不存在相互作用的蛋白質(zhì)檢可能會發(fā)生結(jié)合（況且有一些蛋白之間必不可少的會發(fā)生結(jié)合）。為了是否是此種情況，可以標記細胞中的所有蛋白質(zhì)，然后用裂解緩沖液裂解細胞，裂解緩沖液包括未標記的目的蛋白。因為這種未標記的蛋白不能與通過co-IP回收的用于復合物形成的放射性標記的蛋白競爭。因此，可得出結(jié)論是否為正常生理狀態(tài)下的相互作用。