某些物質(zhì)在光的照射下，吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，可以電磁輻射形式放出所吸收的光能，此現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。在此現(xiàn)象中，如用一短波長(zhǎng)的光照射該物質(zhì)，它在極短的時(shí)間內(nèi)能發(fā)射出波長(zhǎng)比照射光長(zhǎng)的光，即為熒光。熒光素是一些具有這種特性的染料。20世紀(jì)40年代，F(xiàn)ITC異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體檢測(cè)可溶性肺炎球菌多糖抗原，并獲得成功。從此創(chuàng)建了免疫熒光抗體標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)將抗原抗體反應(yīng)的高特異性與熒光的敏感可測(cè)性有機(jī)結(jié)合起來(lái)，可以準(zhǔn)確、特異、靈敏、快速地檢測(cè)和定位未知且微量的抗原，目前已廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究的多種領(lǐng)域及學(xué)科。

FITC標(biāo)記抗體的原理

FITC異硫氰酸熒光素是目前較為常用的標(biāo)記抗體的方法，F(xiàn)ITC一般呈黃色、褐色或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定在低溫中能保存數(shù)年。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的碳酰胺鍵可與抗體蛋白上的賴氨酸氨基共價(jià)結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個(gè)抗體分子上最多能標(biāo)記15~20個(gè)FITC分子，被標(biāo)記的抗體仍能保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力，在熒光燈源紫外線或藍(lán)紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察或利用流式細(xì)胞儀分析，從而對(duì)抗原進(jìn)行定性、定位或定量。

FITC標(biāo)記抗體方法

FITC抗體標(biāo)記主要有Marshall直接標(biāo)記法、Chadwick間接標(biāo)記法、改良標(biāo)記法和透析法四種。

Marshall直接標(biāo)記法

  • 抗體的準(zhǔn)備：取提純的Ig溶液測(cè)定蛋白質(zhì)含量，置于三角燒瓶中加入生理鹽水和0.5mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液，冰槽中攪拌5~10min；
  • 熒光素的準(zhǔn)備：按每毫克蛋白質(zhì)加0.01~0.02mg的FITC計(jì)算，準(zhǔn)確稱取后加入抗體溶液中；
  • 標(biāo)記：邊攪拌邊加入熒光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱或冰庫(kù)繼續(xù)攪拌12~18h；
  • 透析：結(jié)合完畢后，先將結(jié)合物以3000r/min離心20min，除去少量沉淀物后裝入透析袋中再置于pH8.0緩沖鹽的燒杯中透析過(guò)夜；
  • 過(guò)柱：取透析過(guò)夜的標(biāo)記物，過(guò)葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離的FITC，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定。

Chadwick間接標(biāo)記法

  • 抗體的準(zhǔn)備：0~4℃下，用0.01mol/L pH8.0 PBS將待標(biāo)記的抗體蛋白溶液稀釋到濃度為30~40mg/ml，置于三角燒瓶?jī)?nèi)放入冰槽中；
  • 熒光素的準(zhǔn)備：按每毫克蛋白質(zhì)加入0.01mg的熒光素稱取，溶解于等量的3%重碳酸鈉水溶液中；將抗體蛋白溶液與FITC溶液等量混合，在0~4℃中攪拌18~24h，充分?jǐn)噭颍?/li>
  • 透析或過(guò)柱層析。

改良法

  • 抗體的準(zhǔn)備：取提純的Ig溶液測(cè)定蛋白質(zhì)含量，置于三角燒瓶中加入生理鹽水和0.5mol/L PH9.5碳酸鹽緩沖液，冰槽中攪拌5~10min；
  • 熒光素的準(zhǔn)備：按每毫克蛋白質(zhì)加0.01~0.02mg的FITC計(jì)算，準(zhǔn)確稱取后加入抗體溶液中；
  • 標(biāo)記：邊攪拌邊加入熒光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱或冰庫(kù)繼續(xù)攪拌12~18h；
  • 用半飽和硫酸銨將標(biāo)記的抗體蛋白沉淀分離，3000r/min離心30min，傾去上清液中的游離熒光素，再用緩沖鹽水透析除去硫酸銨。將制備好的熒光抗體加0.01%NaN3,分裝保存。

透析法

  • 用0.025mol/L PH9.2碳酸鹽緩沖液，將待標(biāo)記的抗體蛋白稀釋成1%濃度，裝入透析袋中；
  • 用同一緩沖液將FITC制成0.1mg/ml的溶液，置于圓形容器內(nèi)，并將透析袋浸沒(méi)其中，4℃攪拌24h；
  • 取出透析袋中標(biāo)記液。立即過(guò)葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，除去游離熒光素，收集熒光抗體進(jìn)行鑒定。

熒光抗體質(zhì)量控制

FITC熒光標(biāo)記抗體的質(zhì)量鑒定，包括特異性和敏感性的鑒定。

染色特異性和敏感性的鑒定

  • 特異性染色效價(jià)的測(cè)定：直接染色時(shí)以1:2、1:4、1:8等倍比稀釋熒光抗體溶液，與相應(yīng)的抗原標(biāo)本做一系列染色，熒光強(qiáng)度在“+++”的最大稀釋度，即為該熒光抗體的染色效價(jià)。若染色效價(jià)為1:64，在實(shí)際染色時(shí)可采用1:32或1:16。若為間接染色效價(jià)測(cè)定則可先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結(jié)果以抗核抗體熒光強(qiáng)度“++”為標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)際染色用效價(jià)與直接法相同；
  • 非特異性染色：根據(jù)熒光抗體的用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按照常規(guī)染色步驟，結(jié)果在標(biāo)本上出現(xiàn)的非特異性染色應(yīng)顯著低于特異性染色滴度，否則應(yīng)采取消除非特異性染色的方法處理熒光抗體；
  • 吸收試驗(yàn)：在熒光抗體中加入過(guò)量相應(yīng)抗原，于室溫中攪拌2h后，移入4℃中過(guò)夜 ，3000r/min，離心30min，收集上清液，再用其染相應(yīng)抗原陽(yáng)性標(biāo)本，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)明顯陽(yáng)性熒光。

F/P值測(cè)定

熒光抗體的鑒定一般是利用熒光素（F）與抗體蛋白（P）的克分子比值即F/R值，反應(yīng)熒光抗體的特異性染色質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)要求F/R比值為1~2，過(guò)高時(shí)，非特異性染色增強(qiáng)；過(guò)低時(shí)，熒光很弱降低敏感性。具體方法如下：

  • 蛋白質(zhì)定量：測(cè)定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml；
  • 制作熒光素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線： 稱取FITC1mg溶于10ml 0.5mol/l pH9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/L pH7.2 PBS稀釋到100ml，得到的熒光素含量為10ug/ml并作為原液，以倍比稀釋9個(gè)不同濃度的溶液。用分光光度計(jì)在490nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，以光密度為縱坐標(biāo)，熒光素含量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)圖；
  • 結(jié)合熒光素定量：在熒光素和蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長(zhǎng)波方向位移約5nm，讀取數(shù)值后可根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算。

FITC抗體標(biāo)記注意事項(xiàng)

  • 影響標(biāo)記效率的因素有溫度、時(shí)間、pH、熒光素和蛋白的量等，需注意控制；
  • 熒光素及其標(biāo)記抗體的操作過(guò)程注意避光，攪拌速度應(yīng)適當(dāng)避免氣泡的產(chǎn)生；
  • 層析柱裝柱注意正確操作，使柱體均勻、柱面平整，無(wú)氣泡、裂隙；
  • 上樣和洗脫應(yīng)做到“前切”和“后切”。前切指柱頂緩沖液與凝膠平面相切時(shí)再加樣品，后切指樣品走至與凝膠平面相切時(shí)再加入洗脫緩沖液。