目前市面上主要有的三種抗-Flag單克隆抗體是M1、M2和M5。M1單抗應(yīng)用最早，必須在Ca2+的參與下才能和Flag抗原結(jié)合，并且只能特異識別位于N末端的Flag融合蛋白，其應(yīng)用受到較大限制；M2單抗克服了M1依賴Ca2+的缺陷，可應(yīng)用于N端Met-Flag和C端Flag融合蛋白質(zhì)；M5單抗多應(yīng)用于類似N-Met-Flag-C的序列，是用于檢測在細胞質(zhì)表達的Flag融合蛋白質(zhì)的首選抗體。
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Flag抗體的制備流程

單克隆抗體制備步驟及注意事項

合成完全抗原（以Flag與BSA的偶聯(lián)為例）

  • 配制磷酸鹽緩沖液：0.05M PB(pH7.4)、0.01M PBS(pH7.4)；
  • 準確稱量Flag 4mg，溶于0.5mL雙蒸水中；
  • 按照Flag與BSA的摩爾比為30:1確定BSA的量，稱量9mg BSA后溶于0.5mL 0.05M PB(pH7.4)中；
  • 稱量15mg EDC溶于0.5mL雙蒸水中；
  • 將EDC溶解后滴入Flag與BSA的混合溶液中緩慢混合均勻，混勻后，在室溫下?lián)u床100rpm反應(yīng)4h；
  • 4℃靜置過夜；
  • 4℃條件下，用0.01mol/L、pH7.4的PBS透析72h，存儲于-20℃?zhèn)溆?。偶?lián)后蛋白濃度的計算公式：蛋白濃度（mg/mL）=（1.45ⅹA280nm-0.74ⅹA260nm）ⅹ稀釋濃度

間接ELISA檢測

  • 包被：用包被緩沖液將完全抗原（Flag與載體蛋白偶聯(lián)物）稀釋到適當工作濃度，加入到酶標板的微孔中，每孔100μl，4℃過夜。用PBST洗滌5次，拍干；
  • 加待測樣品：將樣品適當稀釋后，按順序加入各孔，每孔100μL，同時設(shè)空白對照、陰性對照各一孔。37℃，孵育30min，洗滌，拍干；
  • 加酶標二抗HRP-IgG：先用酶標稀釋液將HRP-IgG稀釋到適當?shù)墓ぷ鳚舛?，再加入各孔中，每?00μL，37℃，孵育30min，然后洗滌，拍干；
  • 加底物顯色：每孔加入顯色劑A50μL，加完后，再加入顯色劑B50μl，混勻后開始計時，37℃孵育20min。終止反應(yīng)：每孔加終止液(2mol/L H2SO4)50μl；
  • 酶標儀測450nm波長處各孔的吸光度，選取630nm波長處的吸光度作為參比；
  • 結(jié)果判定：陽性閾值（cut-off值）=2.1×陰性（平均值），陰性平均值不足0.05按0.05計算，大于陽性閾值的判為陽性，小于陽性閾值則判為陰性。

    • ②棋盤滴定法確定包被抗原工作濃度

  • 用一系列包被抗原稀釋度進行包被，洗滌，加樣，陽性、陰性血清、空白對照各一孔，孵育，洗滌；
  • 加入工作濃度的酶標抗鼠IgG抗體，孵育，洗滌；
  • 加底物顯色，終止反應(yīng)后，測定吸光度值；
  • 選擇陽性A值為0.8左右，陰性A值小于0.1的包被抗原工作濃度。

制備腹水Flag抗體

步驟流程：腹腔注射0.5mL液體石臘于BALB/c鼠；1～2周后腹腔注射0.5×106~1×106個雜交瘤細胞；接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠瀕于死亡之前，處死小鼠，用移液器將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10mL腹水。

腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/mL。腹水采集后，3000rpm離心5分鐘，棄去上層油脂和下層細胞，用1.5mL離心管分裝成1mL/支，于-20℃保存。

②腹水的純化與保存（正辛酸-硫酸銨沉淀法）

  • 取腹水，4℃，12000rpm離心20min；
  • 棄上層油脂及下層沉淀，加入3倍體積的醋酸鹽緩沖液（60mmol/L，pH4.3），再加入辛酸（25μL/mL），輕微振蕩，混勻；
  • 4℃，12000rpm離心20min后過濾，棄沉淀，留上清；
  • 用1mol/L NaOH調(diào)pH為7.2；
  • 加入硫酸銨（0.277g/mL），振蕩混勻30min，4℃，12000rpm離心20min；
  • 棄上清，將沉淀用適量0.02mol/L pH7.0的PBS懸起，轉(zhuǎn)入透析袋中；
  • 4℃，0.01mol/L pH7.0的PBS透析，72h；
  • 4℃，12000rpm離心20min；
  • 棄沉淀，保留上清于-20℃。

Flag抗體的鑒定

純化抗體純度測定

由蛋白濃度的測定公式求得蛋白濃度：A280nm×1.45-A260nm×0.74=蛋白濃度（mg/mL）；

單抗純化后，根據(jù)純化前后體積，推算出腹水中蛋白含量。

單抗相對親和力測定

  • 以合成的包被原400ng/孔包被酶標板，按行分別加入按一定濃度倍比稀釋的純化單抗，37℃溫育30min，洗滌；加入酶標二抗，37℃溫育30min，洗滌；加底物顯色20min，加終止液終止反應(yīng)，雙波長掃描測定吸光值。
  • 以單抗?jié)舛葹闄M坐標，以所對應(yīng)的OD值為縱坐標作圖，根據(jù)反應(yīng)曲線分析單克隆抗體的相對親和力。
  • 以抗體濃度的對數(shù)值為橫坐標，以所對應(yīng)的OD值為縱坐標作圖，得一曲線，取曲線上最大OD值的50%所對應(yīng)的橫坐標為該抗體的稀釋度，算出該抗體總的稀釋度后，計算親和常數(shù)。親和常數(shù)計算公式：親和常數(shù)K=160000(抗體分子量)/抗體稀釋度×抗體濃度(mg/ml)

參考文獻

[1]王云龍,李忠信,李恒思等. Flag標簽單克隆抗體的制備、鑒定與應(yīng)用研究[D].2010

[2]魯鳳民,李雅娟,莊輝. N-端加flag標簽增加P21Cip1/WAF1蛋白質(zhì)穩(wěn)定性[J]. 2006

[3]詹萬雷,崔東,鄭文嶺等. FLAG融合短肽在重組蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用[J].生命的化學,2004