GFP（綠色熒光蛋白）是從水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白，分子質(zhì)量為26kDa，由238個氨基酸構(gòu)成。實驗室中常用的重組GFP標(biāo)簽更接近水母的GFP，其分子量為27kD左右。
GFP本身是一種酸性、球狀、可溶性天然熒光蛋白。按一定規(guī)則，11條β-折疊在外周圍成圓柱狀的柵欄；α-螺旋把發(fā)色團固定在幾乎正中心處。
圖1：GFP的結(jié)構(gòu)圖示
GFP的發(fā)光機理
物質(zhì)基礎(chǔ)：GFP的生色團
- 由65~67位的絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸（Ser-Tyr–Gly）環(huán)化為穩(wěn)定的對羥基苯咪唑啉酮，形成生色團。
- GFP發(fā)出熒光穩(wěn)定，無需再添加任何底物和輔助因子，在紫外或藍光激發(fā)下就能發(fā)熒光。在450~490nm藍光激發(fā)下，GFP熒光至少能保持10min以上。適合于活體檢測，在激發(fā)光照射下的抗光漂白能力比熒光素強。
- GFP生色團的形成沒有物種特異性，可以在翻譯后2~4h通過自動催化作用來合成。
- 發(fā)色團上的共軛 π鍵能吸收激發(fā)光能量，在很短的時間后，以波長更長的發(fā)射光釋放能量，形成熒光。
例：GFP在水母中能發(fā)光，是因為水母素和GFP之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。水母素在鈣刺激下發(fā)光，其能量可轉(zhuǎn)移到GFP，刺激GFP發(fā)光。這是物理化學(xué)中已知的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）在生物中的發(fā)現(xiàn)。
GFP的熒光特性
- GFP的最大吸收峰為395nm（紫外），并有一個峰值為470nm的副峰（藍光）；發(fā)射光譜最大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰。
- GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）相似，所以GFP觀察可用熒光顯微鏡濾光片組合。
- GFP需在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问健?/li>
GFP的優(yōu)缺點及改進方法
GFP的優(yōu)點
- 易于檢測，靈敏度高；
- 熒光穩(wěn)定；
- 對細胞無毒害作用；
- 廣譜通用性；
- 易于構(gòu)建載體；
- 可進行活細胞實時定位觀察；
- 易于得到突變體；
- 不受假陽性干擾。
GFP的缺點
盡管GFP作為分子探針具有多種優(yōu)點，但野生型GFP仍具有一定缺點：
- GFP有兩個激發(fā)峰影響特異性，且長波激發(fā)峰強度較小，不易觀察；
- GFP合成及折疊產(chǎn)生熒光的過程慢，蛋白質(zhì)折疊受溫度影響大，表達量較低；
- GFP在某些植物細胞中不表達。
改進方法
①除去GFP基因中隱蔽型內(nèi)含子；
②消除編碼蛋白的積累；
③將GFP定位到特定細胞器中；
④改變堿基組分；
⑤更換GFP生色團氨基酸；
⑥插入植物內(nèi)含子；
⑦增加增強子和更換強啟動子。
GFP融合蛋白的構(gòu)建
應(yīng)用亞克隆技術(shù)將目的基因與GFP基因構(gòu)建成融合基因，通過愈傷組織轉(zhuǎn)化法、基因槍、顯微注射、電激轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)化到合適的細胞，利用目的基因的表達調(diào)控機制，如啟動子和信號序列來控制融合基因的表達，最終得到融合蛋白（盡可能不影響目的蛋白的定位和功能）。
目的蛋白與GFP基因融合方式：
- 目的基因-GFP（將GFP置于目的基因之后）
- GFP-目的基因（將GFP置于目的基因之前）
注意事項：
- 兩個基因之間用Linker連接；
- 在兩個基因交接處增加一段核苷酸（3的倍數(shù)）使得兩個基因的蛋白產(chǎn)物的空間結(jié)構(gòu)相互影響較小，有利于GFP發(fā)光；
- 基因在GFP之前時必須要有起始密碼，不能有終止密碼；基因在GFP之后必須有終止密碼；
- 構(gòu)建融合基因后，必須測序進行驗證，確保融合基因讀框正確之后才能進行后續(xù)研究。
GFP融合蛋白的檢測
- 定性檢測：可以用常規(guī)的落射熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡觀察；
- 定量檢測：免疫印跡法，酶聯(lián)免疫吸附法；
- 可以在活細胞中進行圖像分析，也可以檢測固定細胞中的GFP。
注意事項：
- 以GFP作為報告基因研究蛋白亞細胞定位，必須作對照。必須識別自發(fā)熒光與GFP的綠色熒光，以免假象干擾；
- 構(gòu)建正確的融合基因不一定都能正常表達，要盡可能多的獲得轉(zhuǎn)基因細胞。