GST融合蛋白的表達與純化

純化實驗方法

材料準(zhǔn)備：菌種，雌性小鼠（6~8周齡），LB液體培養(yǎng)基，氨芐青霉素，細(xì)菌裂解緩沖液，吸附緩沖液，洗脫緩沖液等（材料未詳細(xì)列出，可根據(jù)實驗sop進行準(zhǔn)備）

GST蛋白提取步驟

• 復(fù)蘇菌液：在無菌條件下取10ml LB液體培養(yǎng)基，加入1%體積的菌液，1‰體積的氨芐青霉素（Amp），37℃培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)過夜；
• 誘導(dǎo)表達：取500ml LB液體培養(yǎng)基，加1%體積復(fù)蘇好的菌液，1‰體積的氨芐青霉素(Amp)，擴大培養(yǎng)至菌液OD600約05-0.8。然后加入IPTG至終濃度為1mmol/L，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，5h后結(jié)束誘導(dǎo)（誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間可視具體情況而定）；
• 收集沉淀：將誘導(dǎo)后的菌液在4℃條件下8000r/min離心15min，收集沉淀。加入0.01mol/L pH7.2的PBS洗滌離心后，再收集沉淀；
• 重懸蛋白：將沉淀反復(fù)快速凍融3-4次，用PH8.0的 Buffer A重懸。然后冰浴中超聲波破碎至溶液不再粘稠后，混勻靜置10min，4℃條件下8000r/min離心10min，收集上清備用。

GST融合蛋白的純化步驟

① 細(xì)胞裂解物與50 %谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合，室溫輕搖使其吸附蛋白30min；

② 4℃，2100r/min條件下離心5min，棄上清，取樣進行SDS-PAGE;

③ 沉淀中加入10倍標(biāo)準(zhǔn)體積的PBS后，顛倒混勻，洗去未結(jié)合的蛋白；

④ 4℃，2100r/min條件下離心5min，棄上清，取樣進行SDS-PAGE;

⑤ 重復(fù)步驟③、④至少2次；

⑥ 將蛋白置于-20℃保存或用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫GST融合蛋白。

洗脫步驟如下：

• 沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動10min；
• 4℃，2100r/min離心5min，取上清；
• 重復(fù)以上兩步驟2次，合并3次的上清。

蛋白濃度的測定

用紫外分光光度計測定純化蛋白樣品在260nm和280nm波長的光吸收值，按照下式計算樣品中蛋白質(zhì)含量。計算公式：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=（1.45×A₂₈₀-0.74×A₂₆₀）×稀釋倍數(shù)。

GST蛋白純化常見問題及建議

目的蛋白結(jié)合效率低或不結(jié)合

• 裂解方式：過分的裂解會使標(biāo)簽蛋白變性，阻止其結(jié)合

建議：在裂解過程中調(diào)節(jié)合適的超聲功率和間隔時間或采用溫和的機械/化學(xué)裂解方法。

• 緩沖液條件：谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂在pH值低于6.5或高于8.0時，結(jié)合效率會降低

建議：使用前需用pH為6.5~8.0的PBS進行平衡。

• 蛋白發(fā)生變性或聚集

建議：使用前需用pH為6.5~8.0的PBS進行平衡。

建議：可在裂解前加入1-10mM的DTT，在緩沖液中也加入DTT；蛋白-核酸結(jié)合或蛋白-蛋白結(jié)合可加氯化鈉。

• 蛋白或脂類在介質(zhì)中聚集

建議：及時清洗介質(zhì)或更換新的介質(zhì)。

• 上樣過程：上樣量過載與上樣流速過高均會影響GST標(biāo)簽蛋白的結(jié)合

建議：在上樣過程中要注意控制上樣量與保持低流速。

• GST 融合蛋白發(fā)生聚集沉淀

建議：在裂解Buffer和其他緩沖體系中加入DTT

• GST融合蛋白被過度稀釋

建議：重新濃縮樣品，增加蛋白濃度。

目的蛋白洗脫不下來或洗脫率低

• 洗脫條件

建議：可以通過加大洗脫液體積、降低流速以及延長洗脫液的保留時間等措施提高洗脫效率。

• 樣品沒有經(jīng)過前處理

建議：樣品上柱前必須要經(jīng)過離心或過濾。

• 非特異性吸附

建議：適當(dāng)選擇添加劑降低非特異性吸附。

• 洗脫緩沖液中谷胱甘肽被氧化

建議：洗脫緩沖液需現(xiàn)配現(xiàn)用，另外可以嘗試加入1-5mM的DTT。

洗脫蛋白有雜質(zhì)

• GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

建議：加入蛋白酶抑制劑PMSF。注：絲氨酸蛋白酶抑制劑必須在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。

• GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

建議：使用蛋白酶缺陷型菌株lon-或ompT，或ompT和lon雙缺陷型菌株。