His標(biāo)簽是由6至10個(gè)組氨酸殘基組成的一種表位標(biāo)簽，很容易被標(biāo)簽特異性抗體識(shí)別。His標(biāo)簽是蛋白純化和檢測(cè)的常用標(biāo)簽之一，由于其分子量?。ㄖ挥?.84KD），融合到重組蛋白后，不會(huì)影響標(biāo)記蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生化特性。His抗體可以用于檢測(cè)和His標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位，以及純化、定性或定量檢測(cè)His融合表達(dá)蛋白等，應(yīng)用十分廣泛。

His標(biāo)簽蛋白純化原理

His標(biāo)簽蛋白純化通常采用固定化金屬離子親和層析（IMAC）純化的方法，主要利用介質(zhì)配體螯合的金屬離子吸附純化表面帶組氨酸殘基的蛋白。由于His標(biāo)簽可與多種金屬離子（如 Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，F(xiàn)e2+等）發(fā)生特殊的相互作用，所以可利用蛋白質(zhì)表面的特性，使之被吸附在凝膠柱上，從而達(dá)到分離純化蛋白的目的。組氨酸的殘基上帶有1個(gè)咪唑基團(tuán)，可與Ni2+、Co2+等過(guò)渡金屬離子形成配位鍵而選擇性結(jié)合在金屬離子上，這些金屬離子能夠用螯合配體固定在層析介質(zhì)上，因此帶有His標(biāo)簽的蛋白在經(jīng)過(guò)裝配了金屬離子的層析介質(zhì)時(shí)可以選擇性結(jié)合在介質(zhì)上，而其他雜質(zhì)蛋白則不能結(jié)合或僅能微弱結(jié)合。結(jié)合在介質(zhì)上的His標(biāo)簽蛋白可以通過(guò)提高緩沖液中咪唑濃度進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性洗脫，從而得到純度較高的His標(biāo)簽蛋白。

Ni2+、Co2+和Cu2+是His標(biāo)簽蛋白純化中使用較為廣泛的金屬離子，因?yàn)樗鼈冊(cè)谒芤褐信c組氨酸具有較好的親和性。其中，Ni2+是親和純化實(shí)驗(yàn)中最常使用的，根據(jù)結(jié)合基團(tuán)不同，Ni2+親和層析柱可分為兩類：一類是Ni-IDA，另一類是Ni-NTA。Ni2+有六個(gè)螯合價(jià)位，其中Ni-NTA螯合了四價(jià)，Ni-IDA螯合了三價(jià)。所以，IDA的載量要比NTA高，在同樣條件下，Ni-IDA洗脫時(shí)所需的咪唑濃度要高于Ni-NTA，但其弱結(jié)合能力使金屬離子在洗脫時(shí)容易浸出，與目的蛋白緊密結(jié)合，從而導(dǎo)致分離蛋白產(chǎn)量偏低，產(chǎn)品不純及金屬離子污染等問(wèn)題。NTA的顆粒粒度均勻，粒徑更小，并且螯合鎳更穩(wěn)定，能耐受較高的還原劑，使填料更加穩(wěn)定，鎳離子不易脫落，所以實(shí)際實(shí)驗(yàn)中往往選擇Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行蛋白純化。

His標(biāo)簽蛋白純化步驟

菌體制備

  1. 取2支15ml的試管，每管加入10ml LB培養(yǎng)基、10μl菌種和10μl相應(yīng)的抗生素，放入37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱180rpm過(guò)夜培養(yǎng)16h。
  2. 取800μl上述菌液加入800ml培養(yǎng)基，再加入800μl相應(yīng)抗生素，放入37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱180r/min培養(yǎng)4h，使培養(yǎng)液OD600達(dá)到0.6~0.8。
  3. 加入800μl IPTG誘導(dǎo)劑，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。

菌體破碎

  1. 收集培養(yǎng)的菌液，8000r/min 4℃離心10min，收集管底的菌體。
  2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要取適量菌體加入10ml PBS緩沖液，渦旋振蕩。
  3. 把混合菌體置于冰水浴中，用超聲儀進(jìn)行破碎。將超聲儀器的超聲探頭伸入菌液中，注意不觸及管底和管壁，每次超聲破碎20s，總共四次，中間間隔半分鐘（破碎時(shí)間、破碎次數(shù)和間隔時(shí)間可視具體情況而定）。
  4. 破碎后的菌液會(huì)顯得比較澄清，此時(shí)將菌液于4℃離心機(jī)中8000r/min離心10min，離心時(shí)間也可延長(zhǎng)。
  5. 離心后分離上清和沉淀，分別留樣，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的條帶在上清中還是沉淀中。

蛋白純化

  1. 菌液破碎離心后的上清液中加入2M咪唑溶液使終濃度為20mM，樣品總體積為10ml。
  2. 過(guò)柱子的樣品最好過(guò)0.45μm的濾膜，避免堵柱。
  3. 可溶性蛋白純化

    4. （1） 平衡緩沖液：PH7.4的50mM磷酸緩沖液0.5M NaCl，含20mM咪唑。

    （2） 洗脫緩沖液：PH7.4的50mM磷酸緩沖液0.5M NaCl，含500mM咪唑。

    （3） 取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎后的上清液10ml以0.5ml/min上樣，然后以2ml/管，分管收集。

    （4） 用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。

    （5） 用5ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。

    （6） 再用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20%乙醇，封閉，以備下次使用。

    （7） 此方法是通用方法，若效果不佳，可用50 mM，100 mM，300 mM，500 mM分段洗脫，洗脫5-10個(gè)柱體積左右，1-2ml/min，2ml/管收集。

    （8） 將收集的各濃度梯度洗脫下來(lái)的蛋白，取樣，進(jìn)行SDS-PAGE。

    （9） 根據(jù)SDS-PAGE電泳圖，若有蛋白，則收集蛋白進(jìn)行透析，若上清無(wú)條帶而沉淀中有條帶，則用變性條件下沉淀，做沉淀純化。

南京銘研生物研發(fā)的His標(biāo)簽抗體（貨號(hào): MY1901）是檢測(cè)His標(biāo)簽靶蛋白的可靠工具，它可以識(shí)別位于氨基酸序列不同位置的His標(biāo)簽，包括N末端、C末端或中間位置，并且靈敏度高，可識(shí)別多種His標(biāo)簽蛋白。南京銘研生物生產(chǎn)的每一批His標(biāo)簽抗體均通過(guò)免疫印跡分析或ELISA驗(yàn)證，可助您完成多種蛋白表達(dá)與純化，歡迎咨詢！