His標簽是由6個組氨酸首尾相連組成的短肽，通常連接在蛋白質(zhì)的N端或C端，能夠用于重組蛋白的分離純化。由于His標簽分子量小，其對重組蛋白的結(jié)構(gòu)及生物活性幾乎沒有影響。His抗體能夠特異性識別His標簽，可以用于定性定量檢測His融合蛋白的表達、細胞內(nèi)定位等。

His標簽蛋白純化是原核蛋白表達純化中常用的方法，其特點主要表現(xiàn)在以下幾個方面：

• N-端的His標簽與細菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機制兼容，有利于蛋白表達。
• 采用IMAC方法純化His標簽融合蛋白，操作更加簡便快捷。
• His標簽可與其它親和標簽構(gòu)建雙親和標簽。
• His標簽?zāi)軕?yīng)用于多種表達系統(tǒng)，且純化條件溫和。
• 相比其他標簽，His標簽的免疫原性較低，可直接將純化的蛋白注射入動物體內(nèi)進行免疫并制備抗體。
• His標簽融合蛋白適用范圍較廣，既可在非離子型表面活性劑存在條件下純化，也可在變性條件下進行純化。
• His標簽應(yīng)用廣泛，除純化多組氨酸標簽重組蛋白之外，還可應(yīng)用于ELISA、Western Blot、pull down、凝膠染色和熒光標簽等。

雖然His標簽純化系統(tǒng)具有諸多優(yōu)點和便利，但實驗也會出現(xiàn)一些常見問題，影響到最終蛋白的表達和純化，這時就需要采取一些適當措施解決這些問題。下面就列舉一些His標簽蛋白純化的常見問題，并針對具體問題提出解決方案和優(yōu)化策略。

His標簽純化常見問題及優(yōu)化策略

1．His標簽蛋白不掛柱

• 金屬離子的選擇

如果選擇的是Ni²⁺或Co²⁺可以換成作用力更強的Cu²⁺或Zn²⁺。

• 超聲功率

超聲功率太小可能導(dǎo)致蛋白沒有釋放，功率太大又可能會使蛋白炭化，所以要調(diào)節(jié)超聲功率到合適水平，并且在超聲之前加入溶菌酶。

• 緩沖液條件

適當提高緩沖液PH、降低咪唑濃度或改變鹽濃度都可能提高His標簽蛋白的掛柱能力。

• His標簽是否丟失

通過Western Blot或Anti-His的抗體檢查His抗體是否表達。

• 標簽暴露情況

蛋白表達過程中，標簽暴露可能不充分，可加入適量變性劑（脲、鹽酸胍）使標簽充分暴露。若不能采用變性條件純化，就只能通過增加His標簽長度或改變His添加的位置來解決。

2．His標簽蛋白掛柱后洗脫不掉

• 洗脫條件太溫和

可以通過降低pH和增加咪唑濃度找出最佳的洗脫條件。但PH低于3.5可能會導(dǎo)致Ni²⁺脫落，這時候就需要采用咪唑競爭性洗脫法。

• 蛋白沉淀在柱子上

嘗試減少上樣量和孵育時間，避免蛋白沉淀。

• 非特異性吸附

添加非離子去污劑洗脫緩沖液或增加NaCl的濃度。

3．雜帶較多

• 超聲條件與溫度

檢查超聲破碎的條件是否太劇烈或溫度控制是否合適。

• 蛋白酶的影響

蛋白酶可能會導(dǎo)致部分蛋白被降解，可加入蛋白酶抑制劑。

• 洗脫條件

采用咪唑競爭性洗脫，此外在咪唑洗脫前增加0.5M PH=5的醋酸緩沖液洗脫，在平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton可以避免因為疏水作用導(dǎo)致的非特異性吸附，這樣可以明顯減少電泳雜帶。

• 蛋白相互作用或形成聚合體

蛋白相互作用或者形成聚合體可能會導(dǎo)致雜帶增加，前者可以通過添加表面活性劑和增加離子強度得到改善，后者可以在緩沖液和樣品中加入1-2mM巰基乙醇避免，并且選擇NTA瓊脂糖凝膠。

4．蛋白純度不夠

• 金屬離子結(jié)合能力

純度不夠可能是由于宿主蛋白中一些含有His的天然蛋白結(jié)合在柱子上，可以通過更換結(jié)合能力較弱的Co²⁺，使含有His的雜質(zhì)蛋白無法結(jié)合而標簽蛋白可以結(jié)合。

• 洗脫條件

尋找最合適的結(jié)合洗脫條件，將標簽和雜質(zhì)盡可能分開。

• 雙標簽純化

可以在重組蛋白上同時添加His標簽和其他標簽（如StrepⅡ ），通過兩步親和層析，提高目的蛋白純度。

• 多步驟純化

在親和層析后可進行凝膠過濾層析或離子交換層析，根據(jù)目的蛋白大小或帶電荷等性質(zhì)將蛋白和雜質(zhì)進一步區(qū)分開。