辣根過氧化物酶（HRP）是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，廣泛分布于植物界，以在辣根中含量高而得名，分子質(zhì)量約為40KDa。HRP作為酶標(biāo)記抗體是通過共價(jià)鍵經(jīng)適當(dāng)?shù)姆椒▽⒚嘎?lián)接在抗體上，形成酶標(biāo)抗體后再通過酶對(duì)底物的特異性催化作用，生成有色不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，利用肉眼、光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡可對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。

HRP由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結(jié)合而成，該酶的活性中心含鐵卟啉即輔基，在403nm波長(zhǎng)處呈現(xiàn)最高吸收峰，酶蛋白部分吸收波長(zhǎng)為275nm，HRP的純度為二者的吸光度比值RZ[1] ，該酶與抗體標(biāo)記的方法有多種，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)可分為戊二醛兩步法和過碘酸鈉法兩種方式標(biāo)記抗體。

hrp抗體標(biāo)記

HRP抗體標(biāo)記的方法

戊二醛兩步標(biāo)記法

戊二醛（GA）是常用的雙功能基團(tuán)交聯(lián)劑，它的兩個(gè)功能基可以與HRP和抗體上的氨基結(jié)合，形成HRP-GA-IgG結(jié)合物。在兩步法中先將酶與過量的GA反應(yīng)，形成二者的結(jié)合物，然后再將該結(jié)合物進(jìn)一步與抗體蛋白質(zhì)分子的氨基交聯(lián)，形成酶標(biāo)記抗體。

標(biāo)記步驟

  • 稱取HRP 25mg（RZ=3）溶于0.2ml 12.5%GA溶液中，于室溫下靜置過夜；
  • 反應(yīng)后的酶溶液過SepHadex G-25柱層析，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/min，收集棕色流出液；
  • 將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中；
  • 加入1mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液0.25ml，調(diào)pH至9.0~9.5后，繼續(xù)攪拌3~4h；
  • 加入0.2mol/L賴氨酸0.25ml，混勻后放置室溫2h；
  • 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4℃放置1h；
  • 3000r/min離心30min，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗兩次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/L pH7.4 的PBS 中；
  • 上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15mol/L pH7.4的PBS緩沖液透析，去除銨離子后（用納氏試劑檢測(cè)），10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，加入等量60%的甘油分裝，于4℃或-20℃冰凍保存。

標(biāo)記物質(zhì)量鑒定

用特異性抗原（或抗體）同酶標(biāo)記抗體（或抗免疫球蛋白抗體）作雙向免疫瓊脂糖或免疫電泳測(cè)定，然后用酶的底物使沉淀物顯色，可初步鑒定其活性，最后以直接ELISA對(duì)酶結(jié)合物進(jìn)行滴定。

簡(jiǎn)易過碘酸鈉標(biāo)記法

利用過碘酸鈉將HRP的糖基氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結(jié)合形成Schiff堿 [2]。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定Schiff氏堿。 此方法只適用于含糖量較高的酶。

標(biāo)記步驟

  • 稱取5mg HRP溶解于1ml蒸餾水中；
  • 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；
  • 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜；
  • 加20μl 0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG（抗體，或SPA5mg）在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)；
  • 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH4液，混勻，再置4℃2小時(shí)；
  • 將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M pH7.4 PBS透析，去除銨離子后（用納氏試劑檢測(cè)），10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，加入等量60%的甘油分裝，于4℃或-20℃冰凍保存。分裝前按照10mg/ml的比例加入BSA作為其穩(wěn)定保護(hù)劑。

注意事項(xiàng)

  1. 在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標(biāo)記的抗體也要活性高，效價(jià)高（最低1∶16），純度高，親和力好，這是保證標(biāo)記物效價(jià)高，免疫活性好的首要條件；
  2. 所使用試劑的pH和濃度及用量必須嚴(yán)格掌握。所用試劑，最好（或必需）新鮮配制。如在戊二醛標(biāo)記法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品，因戊二醛儲(chǔ)存過久可形成縮和體（雜質(zhì)），否則影響標(biāo)記效果；
  3. 室溫?cái)嚢钑r(shí)須避光，室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。標(biāo)記物每次透析前，需認(rèn)真檢查防止漏液；
  4. 濃的標(biāo)記物相當(dāng)穩(wěn)定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，只能保存數(shù)周。已配制的使用液應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。

[1] RZ（Reinheit Zethl）值：即純度值，以酶活性中心的最大吸光度（A）與其余非活性酶蛋白部分的A值比較。一般認(rèn)為標(biāo)記酶的RZ值為3.0左右，RZ值越小，酶的純度越差。

[2] Schiff堿：也稱希夫式堿，主要指含有亞胺或亞甲胺特性基團(tuán)（-RC=N-）的一類有機(jī)化合物，通常由胺和活性羧基縮合而成。具有優(yōu)良液晶特性，一般用作有機(jī)合成試劑盒液晶材料。