人鼠嵌合抗體特點(diǎn)

（1）既保留了親本鼠抗體的高特異性和親和力，又使鼠源性成分減少70%左右；

（2）其人源Fc段能有效介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)功能，如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用（CDC）等；

（3）能自由地選擇抗體的型、亞型、類、亞類、大小、結(jié)構(gòu)域及添加糖基化位點(diǎn)等，以利用其不同的生物學(xué)特點(diǎn)及理化特性；

（4）由高效真核表達(dá)載體和人抗體恒定區(qū)組成的嵌合抗體表達(dá)“盒子”可以容許插入不同的鼠單克隆抗體的可變區(qū)，縮短操作和研制周期；

（5）操作相對(duì)簡(jiǎn)單。

技術(shù)與方法

1.可變區(qū)基因克隆

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞株（約107個(gè)細(xì)胞），按照Trizol RNA提取試劑盒的說(shuō)明書抽提細(xì)胞的總RNA，再進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物備用。

擴(kuò)增輕鏈、重鏈的V區(qū)基因

根據(jù)Orlandi等（1989）設(shè)計(jì)的擴(kuò)增小鼠可變區(qū)基因的引物，以上述擴(kuò)增產(chǎn)物為模板擴(kuò)增抗體基因的可變區(qū)?；厥罩劓淰H(約360bp)、輕鏈VL（約330bp）片段，插入T-easy載體，各送3份樣品測(cè)序。測(cè)序所得序列在GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分類及同源性分析。

兩端加入酶切位點(diǎn)

根據(jù)上述PCR產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物，再次進(jìn)行擴(kuò)增，以使抗體可變區(qū)基因片段具有與載體相吻合的酶切位點(diǎn)，便于插入表達(dá)載體?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物備用。

2.嵌合抗體表達(dá)載體構(gòu)建

改造含信號(hào)肽及人工Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因片段的單克隆位點(diǎn)

（1）設(shè)計(jì)含重鏈信號(hào)肽起始位點(diǎn)序列及酶切位點(diǎn)Nhe I的上游引物HLF(KOZAK+4G，即GCCGCCATGG),和含Xho I工位點(diǎn)的下游引物HLR，以質(zhì)粒pAc-κ-CH3為模板，擴(kuò)增出重鏈信號(hào)肽基因片段；

（2）設(shè)計(jì)含Xho I和Kpn I位點(diǎn)上游引物HCF,和含F(xiàn)urin(RKRR)序列及酶切位點(diǎn)Xba I的下游引物HCR，以質(zhì)粒pAc-κ-CH3為模板，擴(kuò)增出重鏈恒定區(qū)基因片段；用Xho I連接上述片段得到含重鏈信號(hào)肽、MCS及重鏈恒定區(qū)的基因片段；

（3）設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)Apa I的上游引物L(fēng)LF,和含EcoR I位點(diǎn)的下游引物L(fēng)LR,以質(zhì)粒pAc-κ-CH3為模板，擴(kuò)增出輕鏈信號(hào)肽基因片段；

（4）設(shè)計(jì)含EcoR I和Hind III位點(diǎn)上游引物L(fēng)CF,和含Pme I的下游引物L(fēng)CR，以質(zhì)粒pAc-κ-CH3為模板，擴(kuò)增出輕鏈恒定區(qū)基因片段；用EcoR I連接上述片段得到含輕鏈信號(hào)肽、MCS及輕鏈恒定區(qū)的基因片段。

構(gòu)建含信號(hào)肽及人工Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因片段表達(dá)空載體

（1） 用合成的含酶切位點(diǎn)（Xba I和Apa I）的2A序列連接上述重、輕鏈，得到含信號(hào)肽及人Ig重鏈及輕鏈C區(qū)基因的基因片段LigC(Leader+Ig Constant)。

（2） 與Nhe I和Pme I雙酶切過(guò)的pcDNA3.1-CA大片段連接，即得到嵌合抗體真核雙表達(dá)載體pcDNA3.1-CA（chimeric antibody，CA）。

圖1：pcDNA3.1圖譜

插入含鼠源Ig重鏈和輕鏈V區(qū)基因

（1） 雙酶切表達(dá)載體pcDNA3.1-CA和純化的VL，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化目的片段后，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出pcDNA3.1-CA-VL陽(yáng)性克隆，富集培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

（2） 雙酶切表達(dá)載體pcDNA3.1-CA-VL和純化的VH，分離純化相應(yīng)的酶切片段。

（3） 重復(fù)上述步驟，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pcDNA3.1-CA-XX（抗原單詞的首字母）。

3.轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞

接種適量Sp2/0細(xì)胞與培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12h后用純化的載體pcDNA3.1-CA-XX DNA,采用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染，按試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。設(shè)置空載體和無(wú)載體的細(xì)胞為對(duì)照。轉(zhuǎn)染72h后，加含MTX的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。2周后將生長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆利用有限稀釋法單克隆化。

4.陽(yáng)性克隆鑒定與篩選

以間接法用抗原和酶標(biāo)羊抗人IgG Fc片段抗體檢測(cè)嵌合抗體的特異性及重組性。以適量抗原包被酶標(biāo)板，加細(xì)胞培養(yǎng)上清反應(yīng)后，再加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶標(biāo)抗體（經(jīng)鼠Ig吸附過(guò)）孵育，顯色后測(cè)A490吸光值。

5.抗體腹水生產(chǎn)

腹腔種植轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞，5-7天后抽取腹水。一只種植雜交瘤細(xì)胞的小鼠有時(shí)可產(chǎn)生多達(dá)10ml的腹水。

參考文獻(xiàn)：

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[2]趙丹,邱冬,韓德敏等.H3N2亞型犬流感病毒鼠/犬嵌合抗體scFv-Fc的制備與活性分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2019,42(03):474-481.