免疫沉淀是利用固定在磁珠等固相支持物上的特異性抗體對(duì)抗原的小型親和純化的方法。在對(duì)細(xì)胞裂解液分離蛋白的檢測方法中，免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用最為廣泛。
什么是免疫沉淀技術(shù)（IP）？
免疫沉淀是基于傳統(tǒng)親和純化方法開發(fā)的，在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A-Beads （預(yù)先將Protein A固定結(jié)合在磁珠上），
根據(jù)抗原與抗體、Protein A與抗體的FC的特異性，形成“抗原-抗體-Protein A-Beads”復(fù)合物，清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白，最終檢測是否存在目的蛋白。與傳統(tǒng)的柱式親和純化相比，免疫沉淀的目標(biāo)是僅分離足夠用于Western Blot或其他檢測方法檢測的蛋白質(zhì)。通?？梢詫⒁烟幚砗臀刺幚淼臉悠愤M(jìn)行比較，從而評(píng)估目標(biāo)蛋白的相對(duì)量。
在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中，用于檢測的抗體可以是預(yù)固定的，或者是游離的。通常，預(yù)固定抗體法更適用于IP，但是，當(dāng)目標(biāo)蛋白濃度較低、抗體與抗原的結(jié)合親和力較弱的情況下，可以使用游離的抗體形成免疫復(fù)合物，效果會(huì)比較好。
免疫沉淀固相物質(zhì)的選擇
對(duì)于小型特定蛋白和蛋白復(fù)合物的分離，磁珠可實(shí)現(xiàn)結(jié)合能力、得率、可重復(fù)性、純度和成本節(jié)約之間的平衡。當(dāng)進(jìn)行手動(dòng)和自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反應(yīng)并立即用于后續(xù)檢測分析時(shí)，磁珠是最佳選擇。利用強(qiáng)力磁力架可將磁珠定位到孵育管的側(cè)壁，使其不阻礙細(xì)胞裂解物抽吸。磁性分離不需要離心，所以不會(huì)導(dǎo)致抗體-抗原結(jié)合破壞和目標(biāo)蛋白損失現(xiàn)象。當(dāng)需要純化大量目標(biāo)蛋白用于下游分析，且特異性抗體較易獲得，瓊脂糖樹脂純化較為適用。
表1:瓊脂糖樹脂和磁珠的比較
| 對(duì)比指標(biāo) | 瓊脂糖樹脂（Agarose Resin） | 磁珠（Magnetic Beads） |
|---|---|---|
| 結(jié)合能力 | 多孔海綿狀結(jié)構(gòu)，表面積-體積比大，抗體結(jié)合率高 | 磁珠直徑小，表面光滑無孔，結(jié)合率偏低 |
| 得率 | 抗體在洗滌過程中易流失 | 溫和洗滌條件，抗體不易流失 |
| 可重復(fù)性 | 完全移除緩沖液可能破壞樹脂 | 磁珠可以完全吸附在分離管壁，不會(huì)被破壞 |
| 純度 | 孵育時(shí)間較長，需要預(yù)純化 | 相互作用完全發(fā)生在磁珠外表面，不需預(yù)純化 |
| 操作性 | 存在大量手動(dòng)操作，時(shí)間長 | 分離不需要離心，可同時(shí)操作多個(gè)樣本 |
免疫沉淀的類型
最簡單的免疫沉淀可用于分離單個(gè)蛋白（抗體的靶抗原）以研究其特性、結(jié)果、表達(dá)、活化或修飾狀態(tài)。IP也用于研究初級(jí)抗體/蛋白與其他蛋白或核酸的相互作用。
- 免疫共沉淀（Co-IP）
- 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）
- RNA免疫沉淀（RIP）
- 標(biāo)簽免疫沉淀
免疫共沉淀是研究蛋白質(zhì)相互作用的常見技術(shù)，基本原理與IP相同。利用抗體共沉淀裂解物中與抗原結(jié)合的抗體或相關(guān)蛋白復(fù)合物。
染色質(zhì)免疫沉淀分析可用于鑒定基因組中與DNA結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白）結(jié)合的區(qū)域。將蛋白質(zhì)與DNA暫時(shí)交聯(lián)固定并剪切DNA，目標(biāo)蛋白與核酸序列一起被沉淀后進(jìn)行DNA鑒定。
原理與ChIP相似，利用RNA結(jié)合蛋白被沉淀后，用RT-PCR或cDNA測序?qū)Τ恋磉M(jìn)行RNA鑒定。
上述免疫沉淀方法中均依賴特異性識(shí)別靶蛋白的抗體，需要抗體很少或不能與胞內(nèi)其他靶標(biāo)發(fā)生交叉反應(yīng)，存在局限性。但利用表位標(biāo)記蛋白，就可以使目的蛋白更易識(shí)別特定抗體并與之結(jié)合產(chǎn)生沉淀。
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中抗體的固定
Protein A/G結(jié)合抗體
Protein A/G是抗體的結(jié)合蛋白，對(duì)多種不同亞類和種屬的抗體具有較高的親和力。如圖所示，Protein A/G與抗體的Fc結(jié)合，將其正確固定，以便沉淀目標(biāo)抗原。
Protein A/G支持物不適合某些特定的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，例如當(dāng)免疫沉淀抗體的種屬或亞類不與這些蛋白結(jié)合，或者當(dāng)含有抗原的樣本是血清時(shí)（血清中包含的抗體會(huì)與免疫沉淀抗體競爭結(jié)合）。
使用交聯(lián)劑固定抗體
除了用Protein A/G直接捕獲抗體外，還可以使用交聯(lián)劑將抗體共價(jià)連接到Protein A/G上。常用的交聯(lián)劑包括DSS和BS3，它們是具有胺基反應(yīng)性的NHS基團(tuán)的短碳鏈。NHS可與伯胺（賴氨酸殘基的側(cè)鏈）反應(yīng)，生成共價(jià)酰胺鍵。如果抗體先與Protein A/G支持物結(jié)合，然后再與交聯(lián)劑溶液混合，則交聯(lián)劑分子可與抗體和Protein A/G相鄰的胺基共價(jià)連接。
交聯(lián)方法可以避免抗體片段共洗脫，并可重復(fù)多次使用。該方法只適用于可與Protein A/G結(jié)合的抗體。由于抗體包含多個(gè)胺基基團(tuán)，且不僅只分布于Fc區(qū)段，因此必須優(yōu)化交聯(lián)劑的用量。如果交聯(lián)劑用量過少或過多，則抗體可能無法連接至Protein A/G上，或者引起抗體結(jié)合位點(diǎn)上的胺基基團(tuán)被過度修飾，進(jìn)而導(dǎo)致抗體無法與抗原結(jié)合。
鏈霉親和素微珠結(jié)合抗體
除了Protein A/G結(jié)合抗體外，也可以用鏈霉親和素微珠去捕獲抗體，這要求抗體是被生物素化的。
