同位素為質(zhì)量不同但化學(xué)性質(zhì)相同的同一種元素。把分子中的某一原子用它的同位素來(lái)代替的方法叫做同位素標(biāo)記。同位素有放射性和穩(wěn)定性兩種，目前在生物學(xué)中常用放射性同位素來(lái)標(biāo)記，它具有檢測(cè)方便、靈敏度高等特點(diǎn)。同位素標(biāo)記可以用于研究物質(zhì)代謝，研究某個(gè)化合物在體內(nèi)的合成或分解情況。放射性同位素標(biāo)記還可用于抗原、抗體及核酸的檢測(cè)等，在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中也可以用作為追蹤藥物作用部位和代謝的手段。

同位素標(biāo)記有很多優(yōu)點(diǎn)，例如可以保持目標(biāo)分子的物理化學(xué)性質(zhì)，具有成本效益且易于使用。常見(jiàn)的同位素標(biāo)記物有²H、¹³C和¹⁵N等。例如用¹³C標(biāo)記的葡萄糖或甘油和¹⁵N標(biāo)記的氯化銨摻入生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，通過(guò)工程菌或細(xì)胞體內(nèi)的酶途徑轉(zhuǎn)化為氨基酸中可預(yù)測(cè)的位置，最終表達(dá)出標(biāo)記抗體或蛋白質(zhì)，用于結(jié)果分析。

同位素標(biāo)記途徑

體內(nèi)標(biāo)記

又稱(chēng)為代謝標(biāo)記，主要是通過(guò)細(xì)胞或簡(jiǎn)單生物體正常的生長(zhǎng)代謝實(shí)現(xiàn)目標(biāo)生物分子的穩(wěn)定同位素標(biāo)記操作簡(jiǎn)單、高效、相對(duì)準(zhǔn)確。

優(yōu)點(diǎn)：

1. 在細(xì)胞或生物體生長(zhǎng)過(guò)程及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程中引入穩(wěn)定同位素，保證了對(duì)蛋白質(zhì)的完全標(biāo)記；
2. 避免了樣品標(biāo)記、處理及分析過(guò)程中的誤差，確保了相對(duì)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性；
3. 是最早被引入蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的同位素標(biāo)記技術(shù)。

缺點(diǎn)：

1. 生長(zhǎng)條件要求精細(xì)可控，主要適用于較為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞生物體，如細(xì)菌、酵母等的蛋白質(zhì)相對(duì)定量研究。

體外標(biāo)記

利用化學(xué)手段在樣品取材后的處理過(guò)程中實(shí)施目標(biāo)生物分子的同位素標(biāo)記，主要包括酶解標(biāo)記和化學(xué)標(biāo)記兩種：

• 酶解標(biāo)記：在蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中加入含有穩(wěn)定同位素的試劑，將含有重同位素基團(tuán)或者分子引入到蛋白質(zhì)或肽段中，主要適用于蛋白質(zhì)等大分子；
• 化學(xué)標(biāo)記：根據(jù)目標(biāo)生物分子的特定官能團(tuán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過(guò)人工設(shè)計(jì)合成能夠與之發(fā)生專(zhuān)屬性化學(xué)反應(yīng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的衍生化試劑，實(shí)現(xiàn)同位素標(biāo)記。此種方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)、肽段或其他小分子的標(biāo)記，應(yīng)用范圍更廣泛。

抗體與放射性同位素碘的標(biāo)記

用放射性碘標(biāo)記抗體是一種有效的標(biāo)記方法。碘是一種非金屬鹵族元素，常用的放射性核素有¹³¹I和¹²⁵I。¹³¹I是最早用于抗體標(biāo)記的核素之一，尤其在腫瘤的診斷與治療方面，其與單抗等的標(biāo)記物已被廣泛應(yīng)用，¹³¹I的半衰期是8.04天，釋放最大能量607keV的β射線和365keV的γ射線。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明，這種放射性核素標(biāo)記物對(duì)腫瘤的早期診斷具有較大的意義，其導(dǎo)向治療不但能夠準(zhǔn)確定位于腫瘤部位，還有高效的殺傷功能。氯胺-T法是常用的碘標(biāo)記方法之一。

① 優(yōu)點(diǎn)

• 來(lái)源充足，價(jià)格低廉；
• 與蛋白標(biāo)記方法穩(wěn)定，建議可行；
• 正常組織滯留時(shí)間短；
• 可用于診斷和治療。

② 缺點(diǎn)

• 所發(fā)射的365keVγ射線能對(duì)患者的正常組織以及醫(yī)務(wù)人員的身體有一定的輻射影響；
• ¹³¹I是高能β發(fā)射體，限制了用于顯像的有效劑量，其高能光子的顯像質(zhì)量不理想；
• 在體內(nèi)易發(fā)生脫碘。

氯胺-T法

氯胺-T是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產(chǎn)生次氯酸，可使I^–氧化成I或I⁺，從而使I⁺取代到抗體分子上，反應(yīng)后加入還原劑偏重亞硫酸鈉(Na₂S₂O₃)以終止氧化，然后用透析或凝膠層析過(guò)濾等方法將碘標(biāo)記抗體蛋白與游離碘分離。此法簡(jiǎn)便快速、易于操作、重復(fù)性好、能獲得純度較高且具有特異活性的標(biāo)記產(chǎn)物。

實(shí)驗(yàn)流程

• 在小離心管內(nèi)加入100ug/100ul的純化抗體，加入10ul 0.05mol/L磷酸緩沖液，再加入10ul（含37mBq）¹³¹I/¹²⁵I；
• 加入10ul氯胺-T（5mg/ml溶于0.05mol/L磷酸鹽緩沖液），孵育時(shí)間不超過(guò)30s；
• 加入100ulNa₂S₂O₃（1.2mg/ml溶于0.05mol/L磷酸緩沖液）作用1min；
• 加入200ulKI溶液（少許結(jié)晶KI溶于0.05mol/L磷酸緩沖液+4%牛血清蛋白）作為載體，以稀釋放射性碘而減少吸附；
• 用Sephadex G-25柱層析除去游離的¹³¹I/¹²⁵I，用4%BSA-PBS洗脫；
• 收集分為0.5ml/管，每管取5ul進(jìn)行比度和標(biāo)記率的測(cè)定。