對(duì)制備的單克隆抗體（McAb）進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定主要包括以下幾個(gè)方面：

1.McAb的Ig類(lèi)型與亞類(lèi)的鑒定

小鼠免疫脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞，其分泌的特異性McAb的本質(zhì)仍是小鼠的不同類(lèi)型的免疫球蛋白（Ig），其中以IgG最常見(jiàn)，其次為IgM。一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類(lèi)型。如果用的是熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來(lái)的抗體一般是IgG類(lèi)或IgM類(lèi)。至于亞類(lèi)一般則需要用雙抗夾心ELISA法來(lái)確定。

實(shí)驗(yàn)步驟：

  • 稀釋CBS中的同種型特異性抗體（每個(gè)待測(cè)樣品需要200μL每種稀釋的抗體）（IgG1、IgG2b及IgG3在PBS中的稀釋比例為1:1000，IgG2a及IgM在CBS中的稀釋比為1：5000，兔抗小鼠IgG-HRP的稀釋比為1:5000～1:20000）。隨后立即在96孔板中加入稀釋后的抗體（100μL/孔），然后將96孔板置于4℃孵育過(guò)夜或在37℃條件下孵育2h。
  • 棄去液體，每孔加300μL洗滌緩沖液，靜置1min，棄去洗滌液，并拍干，如此重復(fù)洗滌3次。最后一次洗滌后，用干凈的吸水紙拍干，以除去殘留的洗滌緩沖液。
  • 每孔加入300μL封閉緩沖液，在室溫下孵育至少1h。
  • 按照步驟2重復(fù)洗滌3次后，每孔加入100μL待測(cè)樣品，在室溫下孵育1h。
  • 按照步驟2重復(fù)洗滌3次后，在稀釋緩沖液中稀釋。每孔加入100μL過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，將板在室溫下孵育1h。
  • 按照步驟2重復(fù)洗滌3次后，每孔加入200μL底物溶液，在室溫下避光孵育10～15min。
  • 每孔加入50μL終止液，輕輕擊打板，使其充分混合。
  • 15min內(nèi)，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

2.McAb特異性鑒定

除用免疫原（抗原）進(jìn)行抗原的檢測(cè)外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其他抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，其目的是為了判斷McAb是否與其他抗原有交叉反應(yīng)?？捎玫姆椒ㄓ校篍LISA法、免疫熒光法、免疫印跡技術(shù)等。

實(shí)驗(yàn)步驟——ELISA法：

  • 以McAb腹水包被酶標(biāo)板后，4℃過(guò)夜。
  • 用1% PBS-吐溫（BSA-PBST）于37℃封閉1h。
  • 加入預(yù)先與AFP共同溫育（37℃，1h）的McAb混合物，在37℃條件下孵育1h，洗滌。
  • 加入酶標(biāo)記多克隆抗AFP結(jié)合物，37℃孵育1h。
  • 洗滌后，底物顯色10～20min。
  • 加入終止液，終止反應(yīng)。
  • 在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。

3.雜交瘤細(xì)胞染色體檢查

  • 正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒。
  • 小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體：SP2/0細(xì)胞為62—68；NS-1為54～64，大多數(shù)為非整倍性，有中部和亞中部著絲點(diǎn)。
  • 雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目接近兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細(xì)胞分泌高效價(jià)的抗體。
  • 檢測(cè)方法通常采用秋水仙素裂解法：

實(shí)驗(yàn)步驟：

  • 在已克隆化培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞中加入終濃度為0.4μg/mL的秋水仙素繼續(xù)培養(yǎng)。
  • 按常規(guī)法低滲處理和固定，冰水滴片，空氣干燥，Giemsa染色。
  • 干燥后封片。
  • 計(jì)算染色體眾數(shù)。
  • 在已克隆化培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞中加入終濃度為0.4μg/mL的秋水仙素繼續(xù)培養(yǎng)。
  • 按常規(guī)法低滲處理和固定，冰水滴片，空氣干燥，Giemsa染色。
  • 干燥后封片。

4.雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水效價(jià)測(cè)定

  • 可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測(cè)定，不同的測(cè)定方法效價(jià)不同。例如：間接ELISA法檢測(cè)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，對(duì)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或腹水作倍比稀釋。當(dāng)最大稀釋倍數(shù)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和單克隆抗體的腹水上清的OD值/陰性O(shè)D值＞2.1時(shí)，為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和單克隆抗體腹水上清的最高效價(jià)。
  • 實(shí)驗(yàn)步驟詳見(jiàn)–單抗制備步驟及注意事項(xiàng)——篩選分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。

必要時(shí)還可以測(cè)定單抗的親和力和識(shí)別抗原表位的能力。