全基因組擴(kuò)增技術(shù)（whole genome amplification，WGA）是一種對(duì)全部基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技術(shù)，其目的是在沒(méi)有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA的總量。WGA主要有以下幾種類型：

DOP-PCR

簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR（degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR）是一種基于PCR技術(shù)的全基因擴(kuò)增方法。

主要原理

使用部分簡(jiǎn)并寡核苷酸引物進(jìn)行PCR反應(yīng)（引物中間含6個(gè)隨機(jī)堿基），首先使用較低的溫度（～25℃）進(jìn)行退火，隨后再緩慢升溫至引物延伸溫度進(jìn)行引物延伸，完成最初幾個(gè)循環(huán)后，再使用較高的退火溫度（～55℃）進(jìn)行多循環(huán)常規(guī)PCR反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)全基因組的擴(kuò)增。

優(yōu)點(diǎn)

  • 操作簡(jiǎn)單。
  • 產(chǎn)物產(chǎn)量較高。

缺點(diǎn)

  • 起始模板量低時(shí)，擴(kuò)增偏差大。
  • 引物與模板間的不確定性以及引物間的相互作用均可能導(dǎo)致較低的全擴(kuò)增靈敏度及較高的錯(cuò)誤率。
  • 聚合酶及引物濃度需要進(jìn)行優(yōu)化。

LM-PCR

連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR（ligation mediated PRC，LM-PRCR）指的是有接頭連接過(guò)程參與的PCR反應(yīng)。

主要步驟

  1. 模板DNA的片段化處理：物理剪切或限制性內(nèi)切酶處理使DNA裂解成小片段。
  2. 模板片段與接頭連接：根據(jù)酶切片段類型設(shè)計(jì)可與之連接的接頭，在DNA連接酶的作用下，與模板片段兩端連接，接頭中含有一段外源通用引物序列，用作下一步PCR反應(yīng)中的引物。
  3. 全擴(kuò)增PCR反應(yīng)：連接成功的模板片段經(jīng)引物延伸后兩端形成了通用引物結(jié)合位點(diǎn)，因此可以外源引入的通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，包括接頭在內(nèi)的模板片段可同時(shí)得到擴(kuò)增。

優(yōu)點(diǎn)

  • 靈敏度高。
  • 使用通用引物擴(kuò)增均勻。
  • 產(chǎn)物產(chǎn)量高。
  • 對(duì)模板DNA質(zhì)和量要求低。

缺點(diǎn)

  • 操作繁瑣。
  • 多步操作易丟失模板DNA。

PEP

PEP擴(kuò)增前引物延伸反應(yīng)（primer extension pre-ampification，PEP）是基于PCR技術(shù)發(fā)展而來(lái)的全基因擴(kuò)增方法。

主要原理

使用隨機(jī)引物（15個(gè)堿基，415種組合）進(jìn)行PCR反應(yīng)，首先在37℃退火溫度下進(jìn)行退火，隨后緩慢升溫至55℃進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的引物延伸，如此反復(fù)多個(gè)循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)全基因組的擴(kuò)增。

優(yōu)點(diǎn)

  • 操作簡(jiǎn)單，易改進(jìn)。
  • 對(duì)模板DNA質(zhì)和量要求低。

缺點(diǎn)

  • 產(chǎn)量低。
  • PCR過(guò)程中可能在序列中引入錯(cuò)誤和非特異性擴(kuò)增引物，存在擴(kuò)增偏差，錯(cuò)誤率高。

MDA

多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification，MDA）是目前最常用的全基因組擴(kuò)增方法，該方法通常利用噬菌體Phi29 DNA聚合酶和隨機(jī)引物（硫代磷酸鹽修飾過(guò)的）來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。

主要原理

在恒溫30℃條件下，隨機(jī)引物與模板DNA隨機(jī)退火結(jié)合，隨后在高保真，強(qiáng)鏈置換活性的噬菌體Phi29 DNA聚合酶作用下，發(fā)生鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，被置換產(chǎn)生的單鏈產(chǎn)物又成為新的復(fù)制模板，再進(jìn)行擴(kuò)增，如此循環(huán)，最后產(chǎn)生大量片段大小為12kb～100kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。

優(yōu)點(diǎn)

  • 不需要特殊儀器。
  • 保真性強(qiáng)的擴(kuò)增能力。
  • 擴(kuò)增產(chǎn)物的量穩(wěn)定、片段較長(zhǎng)。

缺點(diǎn)

  • 起始模板量低時(shí)，擴(kuò)增偏差大。
  • 對(duì)模板質(zhì)量要求高，可能產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。

pWGA

基于引物酶的全基因組擴(kuò)增技術(shù)（primer-based whole genome amplification，pWGA）是一種恒溫全基因組擴(kuò)增方法，該方法利用噬菌體T7 gp4引物酶在模板上合成引物，從而消除了添加合成引物的需求。T7 gp4是一種雙功能蛋白，既可以用作DNA解旋酶，又可以用作引發(fā)酶。

主要原理

在恒溫37℃條件下，噬菌體T7 gp4使DNA模板變性并合成引物。隨后多位點(diǎn)合成的引物通過(guò)DNA聚合酶進(jìn)行延伸，溫育30～120min后，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)模板DNA的擴(kuò)增。最后在65℃下滅活T7 gp4酶20min，終止反應(yīng)。

優(yōu)點(diǎn)

  • 操作簡(jiǎn)單，不需要使用任何引物以及對(duì)模板進(jìn)行與變性處理。
  • 產(chǎn)量高。
  • 對(duì)模板質(zhì)和量要求低。

缺點(diǎn)

  • 使用的蛋白（酶）以及試劑較多，保真性稍差。

MALBAC

多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）是基于哈佛大學(xué)謝曉亮院士等在2012年研究出的一項(xiàng)專利技術(shù)，是目前最先進(jìn)的全基因組擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)的關(guān)鍵是添加了短的特殊的DNA分子作為引物（含35個(gè)核苷酸）。這些引物由兩部分組成，其中8個(gè)核苷酸的粘性部分變化多樣，可與模板DNA隨機(jī)組合，另27個(gè)核苷酸組成一段共同的固定序列，通過(guò)將自身?yè)饺氲叫驴截愭?，從而自身成環(huán)，防止DNA過(guò)度拷貝。

MALBAC技術(shù)原理

優(yōu)點(diǎn)

  • 操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高。
  • 降低PCR擴(kuò)增偏倚，使得單細(xì)胞中93%的基因組能夠被測(cè)序。
  • 靈敏度高。
  • 擴(kuò)增均勻性顯著優(yōu)于其他技術(shù)。
  • 擴(kuò)增產(chǎn)物用途廣泛。

缺點(diǎn)

  • 模板拷貝數(shù)極低時(shí)易擴(kuò)增偏差，可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。