scFv單鏈抗體（Single-chain variable fragment），是由抗體重鏈可變區(qū)（heavy chain variable domain，VH）和輕鏈可變區(qū)（light chain variable domain，VL）通過(guò)一個(gè)10-25個(gè)氨基酸組成的柔性短肽（linker）連接而成，是最小的重組抗體形式（約27 kDa）。
本質(zhì)上，scFv是一種融合蛋白，并保留了原始免疫球蛋白對(duì)抗原的特異性。scFv較小的分子尺寸，帶來(lái)了強(qiáng)大的腫瘤內(nèi)穿透力、在血液中快速降解、人體內(nèi)負(fù)反饋小等優(yōu)勢(shì)，這也為scFv的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
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scFv的結(jié)構(gòu)
scFv的構(gòu)成可以是VH的N端通過(guò)linker與VL的C端相連，反之亦可。一般而言，scFv的組裝順序不會(huì)影響其特性，而linker的構(gòu)成與長(zhǎng)度會(huì)對(duì)scFv結(jié)構(gòu)造成很大影響，它不僅承擔(dān)了scFv的空間結(jié)構(gòu)，也會(huì)影響scFv的親和力甚至藥動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
Linker的設(shè)計(jì)
最常見(jiàn)的linker是靈活性較好的(Gly4-Ser)3 ，這不單單是由于Ser與Gly會(huì)讓短肽具備了一定彈性、抗蛋白酶酶切的能力，還會(huì)增加scFv的可溶性。
當(dāng)linker的長(zhǎng)度小于12個(gè)氨基酸殘基時(shí)，scFv分子不會(huì)折疊成功能性的單一Fv結(jié)構(gòu)域，而是會(huì)與另一個(gè)scFv組成一個(gè)二價(jià)的二聚體，一般稱為diabody。進(jìn)一步減少linker的殘基數(shù)量，diabody會(huì)與第三個(gè)scFv組成一個(gè)三聚體，稱之為triabody。此外，也可以通過(guò)串聯(lián)的方式組成二價(jià)scFv，三價(jià)scFv等，這種方式組成的二價(jià)、三價(jià)scFv分別稱串聯(lián)二價(jià)抗體（tandem di-scFvs）和串聯(lián)三價(jià)抗體（tandem tri-scFvs）。
scFv的擴(kuò)展結(jié)構(gòu)
除去上述通過(guò)改變linker生成的多價(jià)scFv，也可以通過(guò)其他方式獲得更多特殊結(jié)構(gòu)，應(yīng)用于各類不同的場(chǎng)景。
針對(duì)某些對(duì)穩(wěn)定性要求較高的應(yīng)用（如37℃血漿孵育），scFv的穩(wěn)定性就略顯不足，需要進(jìn)一步提升。比如二硫鍵穩(wěn)定型Fv（dsFv），其主要構(gòu)建手段是通過(guò)基因工程技術(shù)，在VH與VL的保守框架區(qū)的特定位點(diǎn)各突變出一個(gè)半胱氨酸，這樣，在表達(dá)過(guò)程中VH與VL之間會(huì)形成一個(gè)穩(wěn)定的二硫鍵。scFv在設(shè)計(jì)上也可以采取dsFv的思路，使用linker的同時(shí)，額外增加一個(gè)二硫鍵，提高穩(wěn)定性。
此外，兩個(gè)針對(duì)不同抗原的scFv通過(guò)linker連接在一起組成的抗體一般稱作雙特異性抗體（Bispecific diabodies）。雙特異性抗體是重組抗體里非常重要分支。
scFv的產(chǎn)生與表達(dá)
當(dāng)前，scFv主要通過(guò)噬菌體展示庫(kù)篩選獲得。根據(jù)抗體基因的來(lái)源，一般將抗體庫(kù)分成天然抗體庫(kù)（naive antibody library）、免疫抗體庫(kù)（immune antibody library）、合成抗體庫(kù)（synthetic antibody library）以及半合成抗體庫(kù)（semi-synthetic antibody library）等幾類?？贵w庫(kù)是否擁有足夠大的容量和足夠豐富的多樣性，是篩選到理想scFv的先決條件。更多內(nèi)容，請(qǐng)查看抗體文庫(kù)構(gòu)建。
scFv抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選
以較為成熟的展示系統(tǒng)是噬菌體展示為例。無(wú)論想要構(gòu)建的抗體庫(kù)是哪種類型，獲得抗體可變區(qū)基因后，一般按照VH-linker-VL或VL-linker-VH的順序?qū)⒒虿迦胫琳故据d體上（如pHEN1）。將載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，scFv表達(dá)并組裝在大腸桿菌的細(xì)胞膜間隙，隨后加入輔助噬菌體（如M13KO7等），scFv就會(huì)以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面或纖毛，噬菌體展示庫(kù)就構(gòu)建完畢。
針對(duì)特定抗原的scFv的篩選一般采取固相化抗原篩選。如酶標(biāo)板、免疫試管、親和柱等。一般對(duì)可溶性抗原直接包被ELISA板，經(jīng)過(guò)幾輪結(jié)合、洗脫，往往就可以篩選到目的抗體。
scFv的表達(dá)
在篩選得到理想的scFv后，表達(dá)小試或大規(guī)模生產(chǎn)即可實(shí)現(xiàn)。相對(duì)于完整的抗體，scFv并不需要復(fù)雜的翻譯后修飾或糖基化，可以直接在原核系統(tǒng)里表達(dá)并表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗原-抗體親和力。也可以選擇在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
scFv的應(yīng)用
正如上文中提到過(guò)的，scFv實(shí)現(xiàn)了從研究到各種疾病的診斷和治療的廣泛應(yīng)用。它們的特異性和低免疫原性使它們成為傳統(tǒng)治療形式的一種很好的替代方法，提高了靶向特定分子的準(zhǔn)確性并避免了不良副作用。
最近幾年，scFv最顯著的應(yīng)用無(wú)疑是作為靶向藥物重要的一部分，即CAR-T中的嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor, CAR）。CAR-T作為當(dāng)下靶向治療中的明星，通過(guò)工程改造的T細(xì)胞進(jìn)行癌癥治療。CAR-T免疫療法的前提是修飾T細(xì)胞以識(shí)別癌細(xì)胞，以便更有效地靶向和破壞它們，而起到識(shí)別和結(jié)合癌細(xì)胞作用的正是嵌合在T細(xì)胞上的scFv。CAR-T已經(jīng)在血液癌癥，HIV，單純皰疹病毒（HSV）中發(fā)揮巨大的作用。
scFv也可以應(yīng)用于疾病的診斷，比如狂犬病病毒的檢測(cè)。在狂犬病感染的情況下，僅在暴露后不久可治療，準(zhǔn)確和精確的診斷對(duì)于患者的生存至關(guān)重要，scFv相對(duì)傳統(tǒng)單抗更便宜，可廣泛普及。
噬菌體展示庫(kù)也可以為抗體治療后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供廣泛的平臺(tái)，包括人源化和親和力成熟等。