Smart-seq
Smart-seq技術(shù)是由美國和瑞典科學(xué)家共同開發(fā)的一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，其能夠檢測(cè)mRNA的全長(zhǎng)。
測(cè)序原理
用莫洛尼鼠類白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase，MMLVRT）逆轉(zhuǎn)錄全部RNA，然后加入PCR引物，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，再進(jìn)一步將擴(kuò)增的cDNA打斷，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的Illumina測(cè)序文庫。
Smart-seq關(guān)鍵技術(shù)
- CDS引物：（5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN3’，V代表A、C或G，N代表A、T、C或G）：兩個(gè)末端核苷酸將引物錨定在poly(A)尾巴的開始處，這樣就保證了逆轉(zhuǎn)錄的起始位置正好是mRNA的3’端的序列終止位置。
- 引物2：由一段通用序列及它的3’端是3個(gè)非脫氧的G堿基構(gòu)成（RNA的G堿基），這個(gè)引物可以與新合成的cDNA的3’端的幾個(gè)C堿基互補(bǔ)雜交。
- MMLVRT：同時(shí)具有模板轉(zhuǎn)換和末端轉(zhuǎn)移酶的活性，其在轉(zhuǎn)錄到mRNA的5’端末端的時(shí)候，會(huì)在新合成的cDNA的3’末端，多出幾個(gè)C堿基。
Smart-seq測(cè)序流程
- 分離獲得單個(gè)細(xì)胞，并將單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低滲裂解緩沖溶液（裂解液中含有RNase抑制劑）中進(jìn)行裂解，轉(zhuǎn)錄組釋放于裂解液中。
- 加入MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、oligo(dT)VN Primer、MgCl2等，對(duì)mRNAs進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一條鏈，同時(shí)由于MMLVRT的末端轉(zhuǎn)移酶活性會(huì)向cDNA的5’末端加上非模板化的胞嘧啶（C）殘基。
- 引物2對(duì)所加的C堿基進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，然后引導(dǎo)MMLVRT再次發(fā)揮聚合作用，得到雙鏈cDNA。
- cDNA合成之后，進(jìn)行12-18個(gè)循環(huán)的cDNA PCR擴(kuò)增（100 pg的總RNA，需要15個(gè)循環(huán)，對(duì)于10 pg的總RNA，可以進(jìn)行18個(gè)循環(huán)），將擴(kuò)增的cDNA用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的Illumina測(cè)序文庫。
優(yōu)點(diǎn)
- 完整閱讀mRNA5’端。
- 可用于篩選SNPs。
- 不需要知道m(xù)RNA的序列。
- 使用低于50pg的起始材料。
- 高水平的可定位序列。
- 突出優(yōu)點(diǎn)是可以篩選單核苷酸多態(tài)性（SNPs）和變異體。
缺點(diǎn)
- 不穩(wěn)定，低水平表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組可能丟失。
- 轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度偏向性，對(duì)超過4Kb的序列不能高效轉(zhuǎn)錄。
- 并非鏈特異的。
- 價(jià)格較高。
Smart-seq2
Smart-seq2是經(jīng)Smart-seq改進(jìn)的一種測(cè)序方法，也目前最常用的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)之一。
測(cè)序原理
通過設(shè)計(jì)oligo(dT)VN Primer作為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用MMLVRT的模板轉(zhuǎn)換活性，在cDNA的3’端添加一段接頭序列，通過該接頭序列進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA第一條鏈。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶到達(dá)mRNA5’末端時(shí)，會(huì)連續(xù)在末端添加幾個(gè)胞嘧啶（C）殘基。然后添加TSO引物，退火后結(jié)合在第一條鏈的3’端與poly(C)突出雜交，合成第二條鏈。這樣得到的cDNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增，獲得納克級(jí)的DNA，純化后可用于測(cè)序。
Smart-seq2關(guān)鍵技術(shù)
甜菜堿（N，N，N三甲基甘氨酸）是一種高效的甲基供體。在反轉(zhuǎn)錄體系中加入甜菜堿，其能夠增加轉(zhuǎn)錄所需酶（蛋白質(zhì)）的熱穩(wěn)定性，并通過破壞DNA螺旋的穩(wěn)定性降低堿基對(duì)DNA熱融化轉(zhuǎn)變的依賴性。此外，甜菜堿還可以使cDNA的形成更加完整。一些RNA有著例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)、環(huán)形結(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響逆轉(zhuǎn)錄酶與其結(jié)合，加入甜菜堿可解決這一問題，最終得到完整的cDNA文庫。此外，在加入甜菜堿的同時(shí)增加Mg2+的濃度也可在一定程度上提高cDNA產(chǎn)量。
TSO引物序列（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3’）：在5’端帶有1個(gè)通用引物序列，而在3’末端，有兩個(gè)核糖鳥苷（rG）和一個(gè)鎖核苷酸（Locked Nucleic Acid，LNA）修飾的鳥苷（G），可以促進(jìn)模板轉(zhuǎn)換，進(jìn)而擴(kuò)增出完整的cDNA序列。
Smart-seq2測(cè)序流程
- 分離出單細(xì)胞，并用裂解液裂解細(xì)胞。
- 在裂解液中加入MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、游離的dNTPs、oligo(dT)VN Primer、甜菜堿、MgCl2等，通過oligo(dT)VN Primer啟動(dòng)mRNAs反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一條鏈。
- RT反應(yīng)通常在42°C進(jìn)行90分鐘，但是某些RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（例如發(fā)夾或環(huán)），由于空間位阻，可能導(dǎo)致酶終止鏈延長(zhǎng)。通過添加海藻糖和甜菜堿，可以在某種程度上克服這種不良影響。
- 當(dāng)反轉(zhuǎn)錄到達(dá)RNA5’末端后，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)換活性會(huì)在cDNA末端加非模板編碼的核苷酸，通常是dCTP。
- 加入模板轉(zhuǎn)換引物TSO，當(dāng)反轉(zhuǎn)錄到達(dá)mRNA的5’末端，TSO3’的r（G）3和cDNA序列中富含dC的序列依靠互補(bǔ)作用促進(jìn)模板轉(zhuǎn)換。MMLV反轉(zhuǎn)錄酶會(huì)轉(zhuǎn)錄這個(gè)寡核苷酸序列，進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增，獲得雙鏈cDNA。
- cDNA合成之后，加入常規(guī)PCR引物，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的cDNA打斷，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的Illumina測(cè)序文庫。
優(yōu)點(diǎn)
能夠得到全長(zhǎng)cDNA。用于分析可變剪切等。
缺點(diǎn)
只分析帶Poly（A）的RNA。
Smart-seq與Smart-seq2的區(qū)別
- Smart-seq2與Smart-seq相比，使用了鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）、更高濃度的MgCl2以及甜菜堿。
- Smart-seq2不需要純化步驟，比Smart-seq產(chǎn)量更高。
- Smart-seq2只能對(duì)具有polt-(A)尾巴的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。
參考文獻(xiàn)
[1] Picelli S , Faridani O R , Bj?Rklund ? K , et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J]. Nature Protocols, 2014, 9(1):171-181.
[2] Wang Y , Navin N . Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):598-609.