進(jìn)行單細(xì)胞測序，首先要進(jìn)行單細(xì)胞的分離。盡管目前已有多種從異質(zhì)性細(xì)胞群體中分離單細(xì)胞的方法，但分離單細(xì)胞依然是一項(xiàng)巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)。常用的單細(xì)胞分離方法主要有：連續(xù)稀釋法、口吸管技術(shù)、顯微操作法、熒光流式分選法、激光捕獲顯微切割技術(shù)以及微流控技術(shù)等。這些方法各有利弊，要根據(jù)具體情況選擇合適的方法。
連續(xù)稀釋法
連續(xù)稀釋法是指通過對細(xì)胞進(jìn)行一系列的倍比稀釋，最終使細(xì)胞處于單個狀態(tài)，理論上每μL約1個細(xì)胞，然后用移液器吸取相應(yīng)容積的細(xì)胞懸液進(jìn)行單細(xì)胞分離的一種技術(shù)方法。該技術(shù)已成功應(yīng)用于不同組織的干細(xì)胞、前體細(xì)胞體外克隆形成分析的研究。
優(yōu)點(diǎn)：
- 操作簡便。
- 成本低，一般不需要特殊的設(shè)備。
缺點(diǎn)：
- 分離效率低，一般在20%左右。
- 需要研究人員排除大量空白孔和多細(xì)胞孔，費(fèi)時費(fèi)力。
- 細(xì)胞分離過程依賴梯度計(jì)算，容易出現(xiàn)錯誤。
口吸管技術(shù)
口吸管技術(shù)是指在顯微鏡下選擇形態(tài)較好的細(xì)胞，然后用玻璃移液器分離出單細(xì)胞的一種技術(shù)方法。
優(yōu)點(diǎn)：
- 操作簡便。
- 成本低。
- 對細(xì)胞幾乎無損傷。
缺點(diǎn)：
- 對操作人員的熟練度要求較高。
顯微操作法
顯微操作法是指在高倍倒置顯微鏡下，研究人員可以利用顯微鏡操作器（手動或自動）實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞獲取的一種技術(shù)方法。此技術(shù)主要應(yīng)用于目標(biāo)細(xì)胞所在群體數(shù)量較少的樣品的分離。
優(yōu)點(diǎn)：
- 能夠準(zhǔn)確地控制單細(xì)胞的吸取與釋放。
- 可以從不同的發(fā)育階段或多樣化的群體分離單個細(xì)胞。
缺點(diǎn)：
- 通量低，需要大量的起始量。
- 細(xì)胞特異性由顯微鏡決定，并利用微量移液管分離，可能不夠準(zhǔn)確。
流式分選法
流式分選法是一種通過流式細(xì)胞儀，根據(jù)細(xì)胞特異性分子標(biāo)志或者細(xì)胞光散射的特性，分選單個細(xì)胞或者特殊細(xì)胞群的一種現(xiàn)代細(xì)胞分離技術(shù)。
優(yōu)點(diǎn)：
- 高通量。
- 少量細(xì)胞分選時，精度高，速度快。
- 細(xì)胞表面標(biāo)志物的特異標(biāo)記，能夠確保特定細(xì)胞的分離。
- 熒光標(biāo)記可用于分離亞群。
缺點(diǎn)：
- 無法擴(kuò)展到大規(guī)模項(xiàng)目
- 設(shè)備昂貴。
激光捕獲顯微切割技術(shù)
激光捕獲顯微切割技術(shù)是一項(xiàng)在顯微鏡下，從冰凍/石蠟包埋組織切片（或細(xì)胞固定在裝配有可以激光脈沖激活的熱塑膜的涂片）中分離、純化某一類型細(xì)胞群或單個細(xì)胞的技術(shù)。
優(yōu)點(diǎn)：
- 無需解離組織，制備細(xì)胞懸液。
- 能夠在顯微鏡下直觀準(zhǔn)確、快速地獲取單個細(xì)胞或單一細(xì)胞亞群。
- 在天然環(huán)境下從完整組織中快速分離細(xì)胞，保留所分離細(xì)胞的RNA完整性。
缺點(diǎn)：
- 需要適當(dāng)?shù)慕M織處理，組織必須是冷凍保存或固定的。
- 顯微切割可能存在挑戰(zhàn)。
- 小的細(xì)胞可能難以分離。
- 在細(xì)胞分離和組織切割時，可能存在RNA污染。
微流控技術(shù)
在單細(xì)胞研究領(lǐng)域，利用微流控系統(tǒng)分離單細(xì)胞，代表性方法有液滴式微流控和芯片式微流控。其中芯片式微流控的相關(guān)技術(shù)已經(jīng)成熟。其主要是通過微流控芯片隔離流動通道中的單個細(xì)胞從而達(dá)到細(xì)胞分離的目的。
優(yōu)點(diǎn)：
- 高通量。
- 上樣體積小，節(jié)約原料、試劑與樣本。
- 檢測結(jié)果周期短，可以實(shí)現(xiàn)快速測量，節(jié)約時間。
- 可根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物分離特定細(xì)胞。
缺點(diǎn)：
- 單元大小必須均勻。
- 消耗品昂貴。
單細(xì)胞分離技術(shù)總結(jié)如下表：
| 分離方法 | 樣品類型 | 樣品體積 | 通量 | 細(xì)胞完整性 | 費(fèi)用 |
|---|---|---|---|---|---|
| 連續(xù)稀釋法 | 解離的細(xì)胞懸液 | 微升（μL） | ★ | ★★★★★ | ★ |
| 口吸管技術(shù) | 解離的細(xì)胞懸液 | 微升（μL） | ★ | ★★★★★ | ★ |
| 顯微操作法 | 解離的細(xì)胞懸液 | 微升（μL） | ★★ | ★★★★★ | ★★★ |
| 流式分選法 | 解離的細(xì)胞懸液 | 微升（μL） | ★★★ | ★★★ | ★★★★★ |
| 激光捕獲顯微切割技術(shù) | 組織樣本 | 固態(tài) | ★★ | ★★ | ★★★ |
| 微流控技術(shù) | 解離的細(xì)胞懸液 | 納升（nL-pI） | ★★★★★ | ★★★★ | ★★★★★ |