免疫細(xì)胞化學(xué)
免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry，ICC）是利用標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)的靶抗原進(jìn)行定位和定量的一種技術(shù)。標(biāo)記抗體檢測(cè)抗原的方法有兩種：直接法和間接法。直接法是標(biāo)記抗體直接對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè)；間接法是先用一抗識(shí)別抗原，再用標(biāo)記二抗識(shí)別一抗。通過(guò)呈色反應(yīng)或熒光對(duì)細(xì)胞中抗原進(jìn)行定位定量。免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)都是免疫學(xué)的分支，二者在檢測(cè)原理上相同。
抗原抗體檢測(cè)方法
| 直接法 | 間接法 | |
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| 原理 |  |
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| 優(yōu)點(diǎn) |
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| 缺點(diǎn) |
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除了直接法和間接法，常見的抗體檢測(cè)抗原的方法還有夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法，詳情可查看ELISA實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
抗體的標(biāo)記
| 標(biāo)記方法 | 介紹 |
|---|---|
| HRP 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，結(jié)合相應(yīng)底物顯色后觀察 | HRP與不同的底物反應(yīng)產(chǎn)生不同的信號(hào)。該標(biāo)記方法對(duì)于封固介質(zhì)的免疫組化染色應(yīng)用較為理想。且需要阻斷組織的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 |
| AP堿性磷酸酶標(biāo)記 | 是一種能夠?qū)?duì)應(yīng)底物去磷酸化的酶，通過(guò)水解磷酸單酯將底物（蛋白、核酸等）分子上的磷酸基團(tuán)除去。酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類和磷酸。酚和無(wú)色的重氮鹽（顯色原）結(jié)合而產(chǎn)生有色的、不溶性偶氮染料。此標(biāo)記在檢測(cè)時(shí)需要對(duì)組織中的堿性磷酸酶滅活 |
| FITC異硫氰酸熒光素標(biāo)記 | 硫氰酸基團(tuán)可以和蛋白質(zhì)上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成硫脲鍵，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物活性物質(zhì)的熒光標(biāo)記，發(fā)出綠色熒光，直接用熒光顯微鏡觀察 |
| 生物素標(biāo)記 | 生物素與抗體結(jié)合且不影響抗體的活性，是理想的標(biāo)記劑。且一個(gè)抗體分子可偶聯(lián)數(shù)十個(gè)生物素形成一個(gè)生物放大系統(tǒng)，顯著提高了檢測(cè)靈敏度 |
ICC實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化
抗體的選擇
在設(shè)計(jì)免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，抗體的選擇至關(guān)重要。選擇的標(biāo)準(zhǔn)是要減少實(shí)驗(yàn)的非特異性染色，一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇具有最小交叉反應(yīng)的高質(zhì)量抗體。
- 抗體類型：在抗原抗體結(jié)合過(guò)程中，溫度、酸堿度以及鹽濃度的變化等都會(huì)影響抗體識(shí)別抗原表位途徑的變化或是被破壞。單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小容易受到蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的影響；多克隆抗體是異質(zhì)的，不受蛋白構(gòu)象變化的影響。一般而言在一定的酸堿度和鹽濃度范圍內(nèi)，多克隆抗體也比單克隆抗體更穩(wěn)定，多克隆抗體比單克隆抗體更常用于ICC實(shí)驗(yàn)。
- 種屬來(lái)源：根據(jù)一抗的來(lái)源決定二抗的選擇。若一抗是小鼠來(lái)源，那么二抗選擇抗小鼠的即可。
- 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測(cè)什么種屬的抗原選擇抗體，避免出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
固定劑的選擇
目前的免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中固定劑常見為甲醛類和戊二醇類，下面介紹5種常見固定劑以供實(shí)驗(yàn)選擇。
- 95%酒精：常用的細(xì)胞固定液，可加入1%的冰醋酸用來(lái)增強(qiáng)固定效果，且減少了酒精固定時(shí)產(chǎn)生的收縮作用。
- 乙醚酒精固定液：有95%酒精49.5ml、乙醚49.5ml、冰醋酸1ml組成。固定效果較好，但乙醚易燃易揮發(fā)且價(jià)格較貴，故應(yīng)用很少。
- Carnoy液：由無(wú)水酒精：氯仿：冰醋酸=6:3：1組成，固定液穿透力強(qiáng)，固定效果好。一般只用于核酸、糖原和粘蛋白等特殊染色中應(yīng)用。
- 甲醇：固定效果好，核結(jié)構(gòu)保存清晰。常用于瑞氏、MGG染色或免疫組化染色的自然干燥涂片預(yù)固定。
- 丙酮：穿透力強(qiáng)，對(duì)酶類固定效果好，常用于酶的組織化學(xué)染色固定。
固定時(shí)需要注意：
- 根據(jù)染色要求和固定液特點(diǎn)選擇合適的固定液。如巴氏HE染色則選用95%酒精；MGG染色選用甲醇固定液；瑞氏染色以空氣干燥固定為宜。
- 防止交叉污染，保護(hù)固定液濃度。一般酒精固定液濃度低于90%以下時(shí)不作為固定液使用。
- 液體標(biāo)本在涂片后可在空氣中放置片刻，待涂膜周邊稍干而中間未干時(shí)浸入固定液中固定效果更好。