包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)所形成的不溶性蛋白質(zhì)顆粒。包涵體蛋白不具有生物活性，所以給需要制備活性蛋白來開展下游實(shí)驗(yàn)的科研工作者們帶來了諸多不便。那么，如何進(jìn)行包涵體蛋白制備，如何對包涵體進(jìn)行復(fù)性和純化，以獲得有活性的可溶性蛋白呢，請看下文具體介紹。
包涵體蛋白制備
1．包涵體裂解
實(shí)驗(yàn)人員的蛋白通常來自細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞等，需要根據(jù)蛋白的來源
和性質(zhì)不同選擇合適的裂解方法。常見的包涵體蛋白裂解方法有：超聲破碎法、溶
菌酶處理法、細(xì)胞勻漿法、反復(fù)凍融法等，前兩種方法相對來說更常用一些。超聲
破碎步驟可參考His標(biāo)簽蛋白純化，但在超聲之前一般要向溶液中加入1% Triton X-100。
2．包涵體洗滌
包涵體在裂解之后需要進(jìn)行洗滌，因?yàn)榘w中除了含有重組蛋白，還含有RNA
聚合酶、外膜蛋白等雜質(zhì)蛋白以及DNA、RNA核酸片段和多糖等。通過洗滌可以
除去一些影響重組蛋白活性的雜質(zhì)。我們可以使用低濃度的變性劑，如2M尿素在
50mM Tris（pH7.0-8.5），1mM EDTA中洗滌。或者也可以使用一些溫和的去垢
劑如Triton X-100、CTAB等，而去垢劑的洗滌能力會隨溶液中離子濃度的升高而
增加，所以可向溶液中加入較高濃度NaCl。
3．包涵體溶解
包涵體蛋白一般只溶于強(qiáng)的變性劑如尿素（濃度6~8mol/L）和鹽酸胍（濃度5~7 mol/L），它是通過打斷離子間的相互作用進(jìn)而打斷包涵體蛋白分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，從而使多肽能夠正常伸展。
4．包涵體復(fù)性
由于包涵體中重組蛋白的高級結(jié)構(gòu)被破壞，失去生物活性，所以需要采取恰當(dāng)?shù)膹?fù)性方式使蛋白能夠正確折疊。蛋白的復(fù)性可以說是重組蛋白純化中最關(guān)鍵和最復(fù)雜的問題。由于不同蛋白的性質(zhì)存在差異及所處環(huán)境不一，其復(fù)性條件也就大不相同。通常一個(gè)蛋白都會有一個(gè)最佳的復(fù)性條件，只有選擇到了合適的復(fù)性緩沖液，使蛋白能夠正確折疊，才有利于進(jìn)一步的分離純化。
常用的蛋白復(fù)性方法：
| 復(fù)性方法 | 方法介紹 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
|---|---|---|---|
| 稀釋復(fù)性 | 直接加入水或復(fù)性緩沖液以降低變性劑濃度從而使蛋白能夠重新折疊 | 操作簡單 | 易沉淀；速度不易控制；體積大增加較大，后續(xù)處理困難 |
| 透析復(fù)性 | 通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度 | 控制折疊，緩慢進(jìn)行；不增加體積 | 易沉淀；不適合大規(guī)模操作；周期長 |
| 超濾復(fù)性 | 選擇合適載留分子量的膜，允許變性劑通過膜而蛋白質(zhì)無法通過 | 生產(chǎn)中使用較多，規(guī)模較大；易于對透析速度進(jìn)行控制 | 不適合樣品量較少的情況；有些蛋白在超濾過程中發(fā)生不可逆的變性 |
| 柱上復(fù)性 | 通過將目標(biāo)蛋白結(jié)合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，常用于復(fù)性的層析方法有SEC、HIC、親和層析等 | 復(fù)性回收率高；快速、易放大；樣品稀釋倍數(shù)小 |
5．包涵體純化
包涵體復(fù)性以后可以采取與可溶性蛋白相似的方法，包括金屬親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析和疏水層析，詳情見包涵體純化方法介紹。