重組蛋白在大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物中的表達(dá)可分為三種形式：胞外分泌表達(dá)、胞內(nèi)可溶性表達(dá)和胞內(nèi)不溶性表達(dá)（即產(chǎn)物以包涵體形式存在）。以包涵體形式存在的重組蛋白是無(wú)生物活性的，需要進(jìn)行復(fù)性處理，然后再進(jìn)行分離純化。包涵體純化與傳統(tǒng)生物大分子的分離純化方法相似，即以分子的等電點(diǎn)、溶解性、親疏水性以及與其它分子的親和性等特征為基礎(chǔ)進(jìn)行純化。
常用的包涵體純化方法
1. 金屬親和層析
該方法主要利用蛋白質(zhì)表面暴露的一些氨基酸殘基和金屬離子之間的相互作用來(lái)進(jìn)行蛋白純化。我們?cè)谳d體構(gòu)建時(shí)可以加上一些親和性標(biāo)簽（如His標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽等），以便采取親和純化的方式純化蛋白。利用Ni2+和6×His tag之間的親和性，通過(guò)在蛋白的N端或C端加上6～10個(gè)組氨酸，在一般或變性條件下借助它與Ni2+螯合柱的緊密結(jié)合能力，采用咪唑洗脫，或降低PH使組氨酸充分質(zhì)子化，使其不再與Ni2+結(jié)合，從而分離純化出帶有6×His tag的融合蛋白，純度通常能達(dá)到90%以上。
2． 離子交換層析
離子交換層析是根據(jù)在一定pH條件下，蛋白質(zhì)所帶電荷不同而進(jìn)行的分離的方法。常用的離子交換劑有羧甲基纖維素（陽(yáng)離子交換劑，弱酸型）和二乙基氨基乙基纖維素（陰離子交換劑，弱堿型）。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類(lèi)蛋白質(zhì)被留在柱子上，需要通過(guò)提高洗脫液中的鹽濃度等措施將其洗脫下來(lái)。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)合能力不同，洗脫的速度會(huì)存在差異，通常結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)先被洗脫。反之，陽(yáng)離子交換基質(zhì)會(huì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)提高洗脫液的PH或增加洗脫液中的鹽濃度將蛋白洗脫下來(lái)。
3．凝膠過(guò)濾層析
凝膠過(guò)濾層析通常又稱(chēng)為分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀達(dá)到分離和純化的目的。一般是大分子先流出來(lái)，小分子后流出來(lái)。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷并且吸附力弱，可較廣的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。先前就有研究報(bào)道，用Ni親和柱層析純化洗脫的蛋白溶液上樣于Superdex-75柱，經(jīng)過(guò)分子篩的純化，在變性條件下重組蛋白純度達(dá)到95%以上[1]。
4．疏水層析
疏水層析是根據(jù)蛋白質(zhì)表面的疏水性氨基酸殘基的數(shù)目和空間分布不同，從而決定是否能與疏水填料結(jié)合以達(dá)到分離目的。該方法基于的是蛋白質(zhì)的疏水差異，在高濃度鹽溶液中，蛋白質(zhì)會(huì)與疏水配基相結(jié)合，而其他的雜蛋白則不能，由此可以將蛋白質(zhì)初步分離。疏水層析的應(yīng)用與離子交換層析的應(yīng)用剛好互補(bǔ)，因此，可以用于分離離子交換層析很難或不能分離的物質(zhì)。
5．反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移技術(shù)
反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移技術(shù)利用表面活性劑分子在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成反相膠團(tuán)，在一定條件下將溶液中的蛋白質(zhì)分子增溶進(jìn)反膠團(tuán)的極性核中，再創(chuàng)造條件將蛋白質(zhì)抽提至另一水相，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到分離的目的。劉京萍等用CTAB/正辛醇：三氯甲烷(4：1V/V) 反膠團(tuán)體系對(duì)牛血清白蛋白（BSA）進(jìn)行相轉(zhuǎn)移，找到了實(shí)現(xiàn)牛血清白蛋白分離提純的有效方法[2]。但是，該項(xiàng)技術(shù)還存在一些限制，如從有機(jī)相到水相反萃取蛋白時(shí)產(chǎn)率相對(duì)較低。因此，選擇適當(dāng)?shù)捏w系及介質(zhì)條件對(duì)提高蛋白反萃取率具有重要的意義。
包涵體純化方法與可溶性蛋白的純化方法是相似的，關(guān)鍵在于包涵體的溶解與復(fù)性，具體步驟見(jiàn)包涵體復(fù)性方法。
參考文獻(xiàn)：
[1] 張少恩，孫晗笑，張光，等. 大腸桿菌表達(dá)的vMIP-Ⅱ包涵體的純化與復(fù)性研究[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2005, 18(3):247-251.
[2] 劉京萍, 李金. 反膠囊體取牛血清蛋白[J].化學(xué)研究與應(yīng)用, 2004, 16(5):646-649.