單克隆抗體是由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，通常采用雜交瘤技術來制備，雜交瘤抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合為既能穩(wěn)定生長又能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞。單克隆抗體具有理化性狀高度均一（純度高、有效抗體含量高）、生物活性單一、與抗原結合特異性強、來源容易、制備成本低等優(yōu)點，并且可用于疾病的診斷和治療。
單克隆抗體制備原理：
抗體主要由B淋巴細胞合成。每個B淋巴細胞有合成一種抗體的遺傳基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系，含遺傳基因不同的B淋巴細胞可以合成不同的抗體。當機體受外界抗原刺激后，可誘發(fā)免疫反應，產(chǎn)生相應的抗體，即單克隆抗體。B淋巴細胞能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進行無限分裂；腫瘤細胞在體外培養(yǎng)的條件下可以無限傳代，是“永久”的細胞，但不能產(chǎn)生抗體。因此將骨髓瘤細胞與經(jīng)免疫過的小鼠的脾細胞在聚乙二醇等介導下發(fā)生融合，融合后的雜交瘤細胞具有兩種親本細胞的特性，一方面可以分泌特定的抗體，另一方面也具備了腫瘤細胞無限增殖的能力，可在體外培養(yǎng)條件下或移植到體內(nèi)無限增殖，從而分泌大量單克隆抗體。
單克隆抗體制備流程：
1、免疫動物
免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的過程。一般選用6-8周齡Balb/c健康雌性小鼠，按照預先指定的免疫方案進行免疫注射?？乖ㄟ^血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。（抗血清制備——免疫動物）
２、脾細胞的準備
- 拉頸處死小鼠
- 無菌操作取出脾臟
- 清洗研磨，收集細胞
- 離心洗滌
- 細胞計數(shù)
３、骨髓瘤細胞的準備
- 收集細胞
- 離心洗滌
- 活細胞計數(shù)
- 調(diào)整細胞濃度
４、細胞融合
- 骨髓瘤細胞與脾細胞按一定比例混合1：10或1：5。
- 加入50% PEG促融劑（在PEG作用下B淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞）。
- 加入不完全培養(yǎng)液，終止PEG的融合作用，離心，棄上清。
５、雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)
在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏HGPRT和TK，不能利用補救途徑合成DNA而死亡，未融合的B淋巴細胞雖具有HGPRT和TK，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有骨髓瘤細胞與免疫B細胞融合的雜交瘤既有骨髓瘤細胞無限增殖的能力，又從免疫B細胞得到HGPRT和TK的基因產(chǎn)物，因此能在HAT選擇培養(yǎng)基中存活和繁殖。
- 在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細胞死亡，3～4天后瘤細胞消失，可見外形似骨髓瘤細胞，渾圓透亮的雜交瘤細胞形成小集落。
- 觀察雜交瘤細胞生長情況，待其布滿孔底1/10面積時，即可取培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體。
6、篩選分泌抗體的雜交瘤細胞
雜交瘤細胞在融合后2周即可開始篩選抗體活性，通常根據(jù)所研究抗原的特點和實驗室的條件，選擇不同類型的方法。包括：免疫熒光法、放射免疫（RIA）法、組織化學法和酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法等，其中最常用的方法是ELISA法。
7、雜交瘤細胞克隆化
在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化?？寺』窗雅囵B(yǎng)孔中的細胞從單個細胞進行培養(yǎng)繁殖，使之成為單克隆，其分泌的抗體達到均一性。
8、單克隆抗體的大量制備
(1) 動物體內(nèi)誘生法
- 取Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷或液體石蠟進行預處理。
- 腹腔注射接種雜交瘤細胞。
- 約1～2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。
(2) 體外培養(yǎng)法
- 體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞。
- 從上清液中獲取單克隆抗體，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg/mL。
- 離心，去除細胞及其碎片，即可獲得單克隆抗體。
推薦閱讀：