GST標(biāo)簽由211個(gè)氨基酸組成，大小約為26KDa。一般利用重組DNA技術(shù)插入到目的蛋白的C末端或N末端（大腸桿菌中常用在N端），再利用相應(yīng)的抗GST標(biāo)簽抗體進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)以及親和純化實(shí)驗(yàn)中。
GST標(biāo)簽作用機(jī)理
① 應(yīng)用于原核表達(dá)；
● 作為一種高度可溶的蛋白，能增加外源蛋白的可溶性
● 在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到提高表達(dá)量的作用
② GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性；
③ GST在變性條件下會(huì)失去對(duì)谷胱甘肽樹(shù)脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑（如：鹽酸胍或尿素等）；
④ GST融合蛋白已經(jīng)成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的基本工具，其廣泛用于研究蛋白質(zhì)-DNA及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用，也可作為抗原用于免疫學(xué)或疫苗的研究。
GST標(biāo)簽蛋白純化
通常采用親和柱層析法，利用谷胱甘肽（GSH）的結(jié)構(gòu)能夠和GST的結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)，再利用谷胱甘肽交換洗脫的原理對(duì)蛋白進(jìn)行純化。
純化步驟
① 在純化柱中，先將谷胱甘肽偶聯(lián)到瓊脂糖介質(zhì)上（利用SH基團(tuán)能與瓊脂糖介質(zhì)上的環(huán)氧乙烷結(jié)合）；
② 由于谷胱甘肽能與GST-tag發(fā)生特異性結(jié)合，樣品加入純化柱后，帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白被偶聯(lián)在介質(zhì)上的谷胱甘肽配體吸附，而其它蛋白被洗脫；
③ 在非變性條件下加入還原型GSH洗脫液，得到GSH-GST-Protein蛋白復(fù)合物。得到的目的蛋白需要去除GST標(biāo)簽，再應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
GST標(biāo)簽的切除
凝血酶：一種應(yīng)用很廣泛的蛋白酶，主要特點(diǎn)是經(jīng)凝血酶切割后的重組蛋白在切割位點(diǎn)的C端會(huì)保留兩個(gè)氨基酸殘基。凝血酶可以識(shí)別兩種類(lèi)型的氨基酸序列，分別為X4-X3-P-P[K]-X1?-X2?和X2-R[K]-X1?，凝血酶對(duì)前一種序列的識(shí)別效果更為理想。
Xa因子：Xa因子是一種較高效的去除融合標(biāo)簽的工具酶，可特異性識(shí)別I-E[D]-G-R-X1序列，并將融合標(biāo)簽從其C末端切除。
GST標(biāo)簽純化優(yōu)劣勢(shì)
優(yōu)勢(shì)
- 適用范圍廣，可在不同宿主中表達(dá)；
- 增強(qiáng)外源蛋白可溶性；
- 可用不同的蛋白酶進(jìn)行去除；
- 有助于保持蛋白的抗原性與生物活性，提高外源蛋白的穩(wěn)定性；
- 特異性好，純化方便且溫和。
劣勢(shì)
- 分子量較大，可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能和下游實(shí)驗(yàn)；
- 僅能純化可溶性蛋白，若蛋白不可溶，則很難用變性的方法純化。
注意事項(xiàng)
① 當(dāng)融合GST序列的表達(dá)載體表達(dá)時(shí)，部分截短的蛋白產(chǎn)物很容易聚集，可能的原因?yàn)椋?/p>
- GST標(biāo)簽二聚化
- GST標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白之間存在內(nèi)在易斷的連接區(qū)域
- 融合蛋白的mRNA與核糖體結(jié)合不穩(wěn)定共同造成
② GST二聚體的每一個(gè)亞基含有4個(gè)暴露的半胱氨酸殘基，會(huì)導(dǎo)致很明顯的氧化性聚合；
③ 相對(duì)于小分子的短肽標(biāo)簽，GST標(biāo)簽融合表達(dá)時(shí)，需要更多的代謝能量，增加了細(xì)胞代謝的負(fù)擔(dān)；
④ GST標(biāo)簽與谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂的結(jié)合很慢，大規(guī)模純化時(shí)需要更多的時(shí)間上樣；
⑤ GST標(biāo)簽融合蛋白的分子量可能會(huì)影響親和樹(shù)脂的載量，導(dǎo)致80kDa以上的大分子蛋白質(zhì)純化回收率較低。